>试剂均为国产分析纯。UV2100型紫外-可见分光光度计[UNICO(上海)仪器有限公司];瑞士梅特勒-托利多公司AE-200型万分之一电子分析天平。1.2药品与试剂中药饮片黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,橘红为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥外层果皮,三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根。以上中药饮片均于统一购自广东康美,以上中药饮片经广东省中医院中药制剂学实验室丘小惠研究员鉴定符合《中国药典》2000版标准,样品凭证标本存于广东省中医院心脏中心中药标本室。
1.3DPPH溶液的配制精确称取DPPH19.7mg,加少量无水乙醇溶解,用250ml容量瓶,加入95%乙醇定容,配制250ml浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液,待用。
2.1提取分离将组成汤各单味药供试饮片粉碎,45℃恒温干燥2h,置干燥器中存放5d。称取干燥护心方粉末1kg,室温下分别用纯水或80%乙醇加热提取,过滤,滤渣同上重复提取两次,合并滤液,减压旋转蒸发溶剂,得粗提物。将所得粗提物分散于水中,依次用石油醚、醋酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取,每种溶剂萃取3次。合并萃取液,置于圆底烧瓶中,旋转蒸发去除溶剂,分别得石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物、水残留物。
2.2DPPH法测定DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基,若受试物能将其清除,则提示受试物有降低羟自由基(-OH)、烷自由基(R-)或过氧自由基(-O2)和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH实际上是以自由基DPPH-的形式存在的,所以,它有个单电子,在571nm波长处有强吸收,其乙醇水溶液呈很深的蓝紫色,在加入受试物后,在571nm波长处可以动态监测DPPH被清除的效果,这种效果通常用对DPPH的抑制率来表示。显然,抑制率越大,DPPH自由基清除越彻底,受试物的抗氧化性越强。分别准确量取将一定浓度的待测样品对半稀释的0.1ml加入5支10ml比色管中,各加入浓度为0.6mmol?L-1DPPH溶液3.5ml,用蒸馏水定容至5ml,室温下静置反应30min后,在517nm处测定吸光度,因体系内DPPH自由基的浓度与其吸光度成正比,所以可以直接以下式计算对DPPH自由基的清除率[13]。清除率(%)=(A0-A)/A0×100%。
式中:A0为未加样品时测定的DPPH的吸光度;A为加入样品后测定的DPPH的吸光度。
3.1各萃取组分的得率比较两种不同提取方法得到的萃取组分可以得知,调脾护心方醋酸乙酯萃取组分在水提物中所占的比率约为醇提物的两倍(表1),可推测多酚类物质在水提物的醋酸乙酯萃取组分中含量较多;氯仿萃取组分在两类提取物中占的比率很大,我们推测其可能为植物色素类物质;剩余水相是一类很复杂的物质,可能包括游离单糖,氨基酸及其他一些未知成分等。表1各萃取组分得率
3.2各萃取组分的抗氧化能力调脾护心方的各萃取组分具有一定的抗氧化作用(见表2),其中水提物的醋酸乙酯萃取组分清除自由基的能力最强。表2调脾护心方不同萃取提取组分抗氧化能力的比较
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