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商品西洋参DNA指纹图谱鉴别 |
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P0.25μl(100mmol/L)，10×buffer缓冲液2.5μl(无Mg++)，2.0UTaq酶，50ng样品。循环参数为94℃，3min；随后94℃，1min；39℃，45s；72℃，60s；35个循环。最后72℃，3min。
2 结果
2.1 RAPD方法的重复性 为考察本法的稳定性与重现性，将提取的样品放于4℃冰箱，从实验的引物中选取了3个指纹图清晰的引物(S22、S162、S359)先后3次进行扩增，第一次间隔1个月，第二次间隔6个月，所得指纹图谱基本一致，说明本实验具有较高的重复性。
2.2 西洋参的RAPD真伪品鉴别
2.2.1 西洋参及其制剂的RAPD指纹图谱 从常见的西洋参原药材及保健品制剂分别提取了总DNA并进行了PCR扩增，以比较其指纹图谱。从图1可看出，制剂各样品(7～11号)与原药材各样品(1～6号)的指纹图一致，均在281bp,500bp,692bp处有扩增条带。
图1 西洋参原药材及其制剂的指纹图
1.美国威斯康星1994年产；2.加拿大多伦多1995年产；3.辽宁中科院1994年产；4.吉林农业大学1994年产；5.北京怀柔1994年产。6.西洋参组织培养物(北京怀柔，1992)7.人字牌袋泡茶(广州佳怡宝保健品有限公司1996年产)8.番王牌袋泡茶(Totem Ginseng TradingLtd,Canada,1994)；9.许氏袋泡茶(许氏人参企业公司Wisconsin,U.S.A,1993)；10.鹰牌洋参丸(健康药业有限公司，香港，1996)。
引物S30GTGATCGAG
2.2.2 西洋参的真伪鉴别 用103条随机引物对西洋参进行扩增筛选，其中37条引物可得到清晰的指纹图，但能鉴别西洋参及其伪品的引物仅有13条(图2为其中4条，其他9条引物列于表1中)。从图2中可看到，西洋参与人参等4种伪品之间存在着明显的DNA指纹差异，根据这些差异可鉴别西洋参及其伪品。
图2 西洋参真伪品的指纹图
以下5个样品为一组(M为Marker)，各组排列秩序均为1.西洋参；2.人参；3.商陆；4.沙参；5.白芷。
第一组(1～5号)引物为S35TTCCGAACCC；第二组(6～10号)引物为S207GGCAGGCTGT；第三组(11～15号)引物为S350AAGCCCGAGG；第四组(16～20号)引物为S359GGACACCACT。
表1 可用于西洋参真伪鉴别的引物
引物 序 列
S24 AATCGGGCTG
S162 GGAGGAGAGG
S163 CAGAAGCCCA
S205 GGGTTTGGCA
S341 CCCGGCATAA
S344 CCGAACACGG
S358 TGGTCGCAGA
S360 AAGCGGCCTC
S351 ACTCCTGCGA
2.3 西洋参的指纹图差异 我们在筛选引物时发现，大部分西洋参样品，虽然其产地、年代、纯度及模板的降解度并不相同，所得的西洋参指纹图却基本一致［3］；但陕西三个地区样品的指纹图与其他地区的却有明显的差异，如图3及图4所示，两个引物均得到了很好的扩增，1～11号样品的指纹图均基本一致，而12～14号样品的指纹图却与其他地区的不同。
图3 西洋参的变异情况Ⅰ
1.美国威斯康星1994年产；2.美国威斯康星1994年产；3.加拿大多伦多1995年产；4.加拿大多伦多1995年产；5.辽宁中药研究所1994年产；6.吉林农业大学1994年产；7.吉林中国农科院95年产。8.山东莱阳1992年产；9.山东莱阳1994年产；10.北京怀柔1994年产；11.北京怀柔1992年产；12.陕西1号1996年产；13.陕西2号1996年产；14.陕西3号1996年产。
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