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高效液相色谱法测定侧柏叶中槲皮素含量 |
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仲 英 孙立立
提要 采用高效液相色谱法测定侧柏叶中槲皮素的含量。方法简便、专属性强、重现性好，可作为侧柏叶的质量控制方法。
关键词 侧柏叶； 槲皮素； 高效液相色谱
侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis(L) Framco.的干燥嫩枝及叶，是中医临床常用凉血止血、镇咳祛痰药物，为《中国药典》历版收载品种。侧柏叶所含主要成分为黄酮类化合物，鞣质和挥发油类等。其中镇咳祛痰和止血的主要有效成分为黄酮类化合物中的槲皮甙类。黄酮类成分结构比较复杂，一般方法较难将它们分开，目前常用的分析方法多为以芦丁为对照品采用紫外分光光度法测定侧柏叶中的总黄酮含量，因芸香甙(芦丁)与侧柏叶中黄酮类主要成分槲皮甙结构上有所不同，在吸收波长上也有所差异，不能正确地反映出侧柏叶的内在质量。而能够正确反映侧柏叶内在质量的含量测定方法目前尚未见报道。本文选用反相高效液相色谱法，以槲皮甙甙元槲皮素为指标，建立了侧柏叶含量测定方法。实验表明，该法准确、灵敏、快速简便，所选指标槲皮素能够准确地反映侧柏叶的内在质量，可作为侧柏叶质量检测的定量方法。
1 仪器和试剂、材料
1.1 仪器：美国Waters 高效液相色谱仪；Lambda-Max M481检测器；745 Data Module数据处理机；U6KW/Hausing进样器；Millipore MILLIQ-2超纯水制备仪；Resolve C18 (8×100 mm)径向加压色谱柱。
1.2 试剂均为色谱纯、分析纯。
1.3 槲皮素标准品：美国SIGMA公司。
1.4 侧柏叶样品：购自济南、潍坊、烟台、青岛药材站。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：流动相为甲醇-0.5%磷酸溶液(45∶55)；流速1 ml/min；检测波长368 nm；进样量10 μl；数据处理机外标法计算含量。
2.2 不同提取方法的比较：侧柏叶中槲皮甙需经酸水解才能准确测定槲皮素的含量。因此对不同的水解条件进行了槲皮素含量的比较。
2.2.1 不同浓度的酸对槲皮素含量的比较：精密称取侧柏叶1 g，分别按下列方法提取：加60%甲醇50 ml，分别加3%，4%，5%，6%，7%盐酸50 ml加热回流1 h，放冷，过滤。用甲醇定量转入100 ml容量瓶中并稀释至刻度。用0.5 μm的滤膜过滤，按色谱条件测定槲皮素含量。结果表明，3%，4%的盐酸对槲皮甙水解不完全，5%，6%，7%的盐酸基本水解完全，槲皮素含量无显著性差异，故选用5%的盐酸进行水解提取。定量分析结果见表1。
2.2.2 不同水解提取时间对槲皮素含量的影响：精密称取侧柏叶1 g，分别加60%甲醇50 ml，5%盐酸50 ml，按不同时间进行水解提取，按色谱条件测定含量。结果表明1 h即可水解完全。结果见表2。
表1 不同浓度的酸水解对槲皮素含量的影响( n=3)
水解条件 槲皮素含量(%)
3% 盐酸 0.203
4% 盐酸 0.251
5% 盐酸 0.321
6% 盐酸 0.318
7% 盐酸 0.3
表2 不同水解时间对槲皮素含量的影响( n=3)
水解时间 槲皮素含量(%)
15 min 0.223
30 min 0.276
1 h 0.322
1.5 h 0.319
2.3 标准曲线制备：精密称取槲皮素标准品2.5 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。用微量进样器分别吸取不同体积的标准品溶液进样，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作出校正曲线，呈良好线性关系。计算得回归方程 Y=827836 X+5436，相关系数 γ=0.9999。槲皮素进样量在0.25～1.25 μg时，与峰面积呈良好的线性关系，且通过原点，可用外标一点法计算。
2.4 精密度测定：精密量取对照品溶液10 μl，按色谱条件进样6次，测得槲皮素峰面积 Y=4121026， RSD=1.1% ( n=6)。说明本方法精密度很好。
2.5 加样回收率试验：精密称取已知含量的供试样品，精密加入一定量对照品，按样品测定方法测定6次，测得槲皮素的添加回收率。回收率为98.[1] [2] 下一页
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