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Folin 酚试剂法测定蕲蛇蛇毒的蛋白含量 |
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石森林 王黎霞
提要 采用Folin Lowry法测定蕲蛇蛇毒的蛋白含量。该法简便，稳定，重现性好，回收率在98%以上， RSD为1.76%。
关键词 Folin Lowry法； 蕲蛇蛇毒； 蛋白含量
蕲蛇蛇毒为蝰蛇科蝮亚科蕲蛇的毒牙分泌的毒液，是临床中常用的蝮蛇抗栓酶的原料药之一，为了控制其质量，我们对其进行了蛋白总量的测定。
1 仪器、试剂及样品
754分光光度计(上海分析仪器厂)，Metter AE 163电子分析天平(瑞士)；牛血清白蛋白(Albumin Fraction)，Boehringer mannheim Gmblf. Germany，蕲蛇蛇毒(浙江医科大学提供)；化学试剂均为分析纯；Folin试剂甲、乙为自己配制。
2 方法与结果
2.1 供试液的制备
2.1.1 取牛血清白蛋白，精密称定25.00 mg，加蒸馏水到100 ml容量瓶中并至刻度(0.25 mg/ml)为标准蛋白溶液。
2.1.2 另取蕲蛇蛇毒，精密称定12.50 mg，加蒸馏水到100 ml容量瓶中并至刻度(0.125 mg/ml)为测试液。
2.2 标准曲线的绘制：取7对15 ml试管分成两组，每组各分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准蛋白液并以蒸馏水补足1 ml。各加入Folin试剂甲5.0 ml，混匀，于20～25℃放置10 min，再加入Folin试剂乙0.5 ml，立即振摇均匀，在20～25℃保温30 min。然后于500 nm处比色，测定吸收度。以蛋白质浓度 C为横坐标，两组吸收度平均值 A为纵坐标，绘制标准曲线，经回归统计，得回归方程 A=0.0147+1.4553 C， γ=0.9992。表明浓度在25～250 μg/ml范围内，与吸收度呈线性关系。
2.3 稳定性试验：样品液放置0、0.5、1、2、4 h，分别测定，得样品蛋白浓度分别为0.1137、0.1143、0.1140、0.1146、0.1148 mg/ml， RSD为3.88% ( n=5)。表明样品液在4 h内基本稳定。
2.4 重现性试验取5份同一批蕲蛇蛇毒，按上法分别测定，结果蛋白含量分别为91.0%、91.9、91.4%、92.8%、90.3%， RSD为1.03% ( n=5)。
2.5 回收率测定：精确称取一定量的牛血清白蛋白6份，加入已知蛋白含量的蕲蛇蛇毒中，依法测定，结果见表1。
表1 加样回收率测定结果
序号 已知样品
含量(mg) 加入蛋白
量(mg) 测得量
(mg) 回收率
(mg) 平均回
收率(%) RSD
(%)
1 0.056 0.058 0.115 101.72
2 0.058 0.060 0.117 98.33
3 0.061 0.061 0.121 98.36 100.09 1.76
4 0.054 0.059 0.114 101.69
5 0.050 0.065 0.114 98.46
6 0.055 0.063 0.119 101.59
2.6 样品含量测定：取3批蕲蛇蛇毒，依法测定，结果其蛋白含量分别为91.8% RSD为0.98% (n=3)；90.9% RSD为1.12% (n=3)；91.2%， RSD为1.06%(n=3)。
3 小结
蛋白质含量可从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等得知或用化学方法：如定氨、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应(即Folin Lowry法)等方法测定。Folin-酚试剂法灵敏度较高，较紫外吸收灵敏10～20倍，较双缩脲法灵敏100倍左右，且操作简便，迅速，不需要复杂昂贵的设备。为此我们选择了该法测定蕲蛇蛇毒的蛋白含量。从结果来看，本法有较理想的线性关系，其稳定性、回收率、重现性也都较满意，表明可以用本法来测定蕲蛇蛇毒的蛋白含量。
作者单位:石森林 浙江中医学院，杭州 310009；王黎霞 浙江省青田县人民医院 323900
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