CCKBR mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达

　　2 方法

　　2.1 分组及造模

　　2.1.1 动物及分组实验用SD大鼠72只（成都中医药大学动物实验中心提供，SPF级动物），日龄40～45 d，体重（75±10）g，随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、加减益胃汤高、中、低剂量组，每组12只。

　　2.1.2 造模及给药方法除空白对照组外，其余各组参考文献［2］采取特制饲料喂养“病因模拟”法造模。灌胃给药，实验过程中每日记录动物进食量，实验第8天开始灌胃，空白对照组和模型组灌生理盐水，阳性对照组灌服儿宝颗粒，加减益胃汤低剂量组灌服17.5 g生药/kg，加减益胃汤中剂量组灌服35 g生药/kg，加减益胃汤高剂量组灌服70 g生药/kg，1次/d。第28天晚8时起禁食，第29天处死，取标本。

　　2.2 样本提取与保存大鼠处死后，迅速剪取结肠中段, 生理盐水洗尽血迹，去除黏膜层, 取肌层组织并置于液氮中保存待测。

　　2.3  RT－PCR检测CCKB-R表达

　　2.3.1 引物设计与合成  

　　从美国国立卫生院所维护的国际权威数据库网站获得最新版本的CCKB-R和内参基因β-actin的mRNA序列。利用引物设计专业软件Primer Primier 5.0设计其引物。然后委托大连宝生物完成引物合成。将引物溶于去离子水之中，终浓度调整为20 pmol/μl，－20℃保存备用。CCKB受体引物：5 -CTAAGAACGGTCACCAACG；3 -GTGTAAGTAGAAGCCGTG。

　　2.3.2 RNA 提取 

　　采用美国TriZol试剂(Cat NO: 15596-018)，按试剂盒提供的方法提取结肠中段组织中的总RNA，各组使用相同剂量的结肠中段组织总RNA。1.5%琼脂糖电泳确定质量与含量后，－80℃保存备用。

　　2.3.3 RT－PCR

　　按试剂盒说明程序进行，先经逆转录酶系统合成cDNA。PCR仪进行CCKB-R扩增，取10 μl cDNA反应液进行PCR。PCR的条件：①变性：94℃预变性5 min，94℃变性1 min；②退火：54℃，30 s；③延伸72℃，30 s。30个循环后，72℃再延伸10 min终止反应，4℃。CCKB-R PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳（电压100 V，时间30 min），取出后于紫外线下观察，利用凝胶成像系统分别测定扩增条带的积分光密度值。比较各组CCKB-R相对光密度值并进行组间统计，判定CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。

　　2.4 统计学处理数据用SAS 软件包处理，计量资料均以±s表示。多组资料比较用方差分析，两组资料比较用t检验。

　　3 结果

    见表1。表1  实验各组对幼龄厌食大鼠结肠平滑肌
组织CCKB-R mRNA表达的影响（略）

　　表1所示，模型组CCKB-R mRNA表达与空白组比较有显著差异（P＜0.001）；与模型组比较，阳性药组、加减益胃汤高剂量组、中剂量组、低剂量组均使结肠平滑肌组织CCKB-R mRNA表达下调（P＜0.001）；与阳性药组比较，加减益胃汤各组下调CCKB-R mRNA表达程度高于阳性药组，但差异不显著；加减益胃汤各组间比较无显著性差异（P>0.05），但下调CCKB-R mRNA表达水平表现为高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，有一定量-效关系趋势。

　　4 讨论

    胆囊收缩素（cholecystokinion, CCK）是一种广泛分布于中枢及外周神经系

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