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脑损伤大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽的改变 |
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elatel peptide CGRP)及CGRP免疫阳性神经纤维的改变和骨痂量的变化，探讨脑损伤后对骨折愈合的影响，以期从分子水平阐述神经因素对骨折愈合的影响及调控，探讨神经肽与骨折愈合的相互作用的调控过程和机制。
1 材料和方法
1.1 材料 Nikon UFXⅡA显微镜、摄像镜(日本)，HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统(中国武汉)，计算机放射成像系统(Regius model150，日本KONIC公司)，液压脑损伤模型由柳州医疗器械厂制作(参考方加胜教授)［2］，以上设备均由柳州市人民医院提供。主要试剂：试剂
基金项目：广西科技厅青年基金(桂科青0447055)
CGRP购于武汉博士德公司。EDTA2NA(乙二胺四乙酸二钠)骨组织脱钙试剂：瑞兴科技有限公司；磷酸盐缓冲液：福州迈新生物技术有限公司(批号701020060v)。检测方法均按试剂盒要求操作，雄性12周龄wistar大鼠100只，体重(500±50) g，Wistar大鼠由广西医科大学试验动物中心提供(实验动物生产许可证号SCXK2003003，清洁级)。实验过程中于室温20℃自然光照的动物房中分笼饲养，供给大鼠标准饲料，自用饮用水，定期紫外线消毒与排风，喂养1周适应环境后随机分为骨折组和骨折合并脑外伤组，两组间无统计学差异。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 3～4个月龄雄性Wistar大鼠100只，体重450～550 g。随机分为两组，单纯右胫骨折组50只，编为3、7、14、21、28 d小组，每小组10只；脑外伤组加右胫骨骨折组50只，编为3、7、14、21、28 d小组，每小组10只。
1.2.2 模型制作 术前禁食，大鼠随机分组并称重，经氯胺酮(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，常规去毛、备皮、碘伏消毒。显露右颅顶骨，中线旁2 mm处开直径5 mm骨窗，液压打击致中度脑损伤。复苏后，沿胫骨前外侧钝性分离进入到达胫骨干，在胫骨骨干中1/3段用摆锯锯断成横形骨折，以直径1 mm克氏针作逆行髓内固定，经查骨折固定牢固后，生理盐水冲洗，关闭伤口，碘伏再消毒。骨折组头部只做颅骨开窗，正常对照组不做任何处理，术毕分笼饲养。
1.2.3 标本采集和处理 分别将受试大鼠经氯胺酮(1 mL/kg)腹腔内注射麻醉后，于术后第3、7、14、21、28天心脏取血处死，每组各10只，取血4～6 mL离心后取血清贮存(－70℃)待测；待血清收集齐后一批进行检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的含量。处死大鼠后立即取带骨膜和少许肌肉的右胫骨，照片后置于装有4％多聚甲醛(pH7.2)瓶中，标明动物编号、日期，放入4℃冰箱中固定24 h。之后取出，充分水洗后，PBS液浸泡30 min，放入10％乙二胺四乙酸钠(EDTA)pH7.3溶液中脱钙，每周换2次脱钙液，经5周脱钙后，用针头能轻易扎穿骨皮质，则脱钙充分。接着进行骨痂的免疫组化操作步骤。切片与胫骨纵轴垂直，连续切片，间距为6 um。具体步骤参照试剂说明书。
1.2.4 计算机X线摄像仪(CR)摄片 14、21、28 d将大鼠完整的右侧胫骨干骨折标本经CR摄片(距离：90 cm，电压：40 Kvp，电流：3.0 mA)，观察大鼠胫骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况。所得图像运用photoshop7进行处理，计算骨痂面积大小、不同骨痂比例。
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