|
冠心病痰瘀证候与 选择素 及 基因多态性的关系研究 |
| |
|
联免疫法测定具体操作方法：（１）血清标本置于室温下解冻；（２）按说明准备试剂、标准品及样本；（３）每孔加入100μL测定稀释液；（４）每孔加入１００μL标准品或已稀释的样本。室温下在振荡机上以（５００±５０）r/min进行振荡，孵育15h；（５）抽吸清洗６次，将微孔在吸水纸上扣干；（６）每孔加入１００μL酶联物，室温下振荡孵育３０min；（７）每孔加入１００μL显色液，室温避光孵育1h；（８）每孔加入５０μL终止液，３０min内在４５0nm处读Ｄ值；（９）以Ｄ值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的Ｄ值可在标准曲线上查出其浓度。Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系研究Eselectin Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型检测的ＰＣＲＲＦＬＰ基因分析法：（１）使用试剂：ＤＮＡ分子标准ＤＬ２０００ Marker（大连宝生物公司）、QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司产品）、Taq DNA Polymerase（北京索奥公司产品）、DNTPs（北京索奥公司产品）、HphI限制性内切酶（NEB公司产品）、PstI限制性内切酶（TAKARA公司产品）;（２）外周血白细胞ＤＮＡ的提取（操作方法按照试剂的说明书进行）：全部受试者均取外周静脉血2mL，ＥＤＴＡ抗凝，采用Qiagen DNA抽提试剂盒提取基因组ＤＮＡ，步骤如下：①取１５mL离心管，注明名字及编号；②管底加ProteaseK 20μL，全血２００μL，Buffer AL 200μL，混匀后５６℃水浴１０min;③取无水乙醇２００μL加入管中，混匀，转移入Spin Column,8000r/min离心５min;④弃滤液，Spin Column转移入清洁收集管中，加ＡＷ１液５００μL，8000r/min离心５min；⑤弃滤液，Spin Column转移入另一清洁管中，加ＡＷ２液５００μL，8000r/min离心５min；⑥弃滤液，Spin Column转移入已标名字的１５mL离心管中，加Buffer AE或蒸馏水２００μL，8000r/min离心５min；-２０℃保存备用。（３）聚合酶链反应：①引物序列：引物序列参考文献［９］并结合Primer Express Software 20版设计，引物序列见表１，全部引物由Invitrogen 公司合成。②反应体系：１０倍PCR Buffer ５μL、１０mmoldNTPs１μL、上下游引物各１０pmol、Taq酶３Ｕ、膜板５μL、加无菌去离子水至５０μL。③反应条件：９３℃３min预变性，９３℃３0s，各外显子参照上述退火温度，共３５个循环，７2℃延伸１０min。反应后检测，取８μLＰＣＲ扩增产物用２0g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，ＰＣＲ产物在２0g/L琼脂糖中电泳检测后-２０℃保存备用。④结果：ＰＣＲ产物经２0g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，片段大小符合预先设计。（４）ＰＣＲ限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲＲＦＬＰ）：①HphI反应体系：PCR 反应混合物 10μL(约1μg of DNA)，10倍NEB Buffer2μL，HphI 1μL，加水、无核酸酶试剂至20μL，温和震荡，短暂离心数秒。３７℃酶切过夜。取10μL酶切产物用２0g/L琼脂糖凝胶进行电泳；②PstI反应体系：PCR 反应混合物 10μL(约 1μgof DNA)，１０倍H Buffer ２μL，PstI 1μL，加水、无核酸酶试剂至２０μL，温和震荡，短暂离心数秒。３７℃酶切4h。取10μL酶切产物用２0g/L琼脂糖凝胶进行电泳。 表1PCR引物序列 Table 1PCR primer sequence基因PCR 引物(5→3)退火温度(℃)长度(bp)G98TTGCCCAAAATCTTAGGATGCAAGCCCAGGGAAGAACACAT59332S128RAGTAATAGTCCTCCTCATCATGACCATCTCAAGTGAAGAAAGA55186 2３统计学方法采用ＳＰ
ＳＳ １１５软件包进行分析。分类资料的组间比较采用χ2检验。计量资料采用±s表示，两组以上均数的组间比较采用One way ANOVA检验，用Bonferroni方法进行两两比较。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计，研究对象与HardyW上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
上一个医学论文： 清热利湿祛瘀中药经直肠给药对慢性前列腺炎患者局部免疫功能的影响
下一个医学论文： 糖尿病中医证型研究近况
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 中医论文 >> 正文