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论新辅助化疗对乳腺癌外周血微转移因子的影响 |
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疗，是新辅助化疗亟待解决的问题。笔者选择细胞角蛋白19(CK19)、血管内皮生长因子(VEGF)和人乳腺球蛋白(hMAM)作为乳腺癌外周血微转移因子进行联合检测研究，探讨新辅助化疗对微小转移灶检测的方法和临床意义。
1 临床资料
选择2006年4月～2009年3月具备新辅助化疗条件的乳腺癌患者48例，年龄35～78岁，平均47.6岁。病理分期：I～II期17例，III期31例;病理分级：浸润性低分化腺癌27例，浸润性中、高分化腺癌21例。
2 方 法
2.1 新辅助化疗方法 48例采用CAF方案行新辅助化疗23例，予环磷酰胺600mg,第1天，氟尿嘧啶500mg,第1天，多柔比星60mg,第1天，两周方案;第1天采用AT方案行新辅助化疗25例，予紫杉醇160mg，第1天，表柔比星60mg，第1天，两周方案。分别于新辅助化疗前第1天和化疗结束后第7天检测外周血中相关基因标志物微转移因子的表达水平。48例患者之前均未行任何治疗。
2.2 检测方法 化疗前和化疗后分别取外周静脉血10ml，弃去采血针抽取的前2ml血，以减少标本被皮肤细胞污染可能，随后取8ml分别加入四支含EDTA的抗凝管中，充分摇匀，以PBS稀释后，采用淋巴细胞分离液离心，收集淋巴细胞和单核细胞层，洗涤后移至EP管，70℃冻存备提取RNA用。
2.2.1 仪器、试剂与引物 Personal Cycler型PCR仪(德国Biometra公司);GelDoc型凝胶成像分析系统(美国Biorad公司);RNA提取试剂盒和RTPCR试剂盒(Takara公司);引物(上海英骏生物技术有限公司)。VEGFC上游引物：5’GCATGAACACCAGCACGAG3’; 下游引物：5’ATGAAGGGACACAACGACAC3’，扩增产物为717bp片段。CKl9上游引物： 5’GCGACTACAGCCACTACTACAC3’ ; 下游引物：5’GAACCAGGCTTCAGCATCC3’，扩增产物为 440bp 片段。 11MAM 上游引物：5’CCGACAGCAGCAGCCTCAC3’;下游引物：5’TCCGTAGTTGGTTTCTCAC3’，扩增产物为338bp片段。内参照βactin 上游引物： 5’AGAAGGATTCCTATGTGGGCG3’ ; 下游引物：5’AAGCATTTGCGGTGGACG3’，扩增产物为979bp片段。
2.2.2 RNA提取及鉴定 取出保存的单核细胞标本，按RNA提取试剂盒中的操作说明书提取总RNA，并根据(A260A320)×稀释倍数×0.04μg/μl值计算RNA的浓度，以A260/A280判定其纯度。
2.2.3 RTPCR反应 按照RTPCR试剂盒操作，βactin分别与VEGF、CK19和hMAM进行同管扩增，PCR产物用1%琼脂糖电泳后，进行凝胶成像分析，并根据VEGF/βactin、CKl9/βactin和hMAM/βactin分别计算各自的相对表达量。
2.2.4 产物鉴定 凝胶成像系统观察，本组VEGF、CK19和hMAM均在内参照扩增产物片段处出现清晰条带，证实RNA无降解和反应体系适当。各自对应的预期产物片段出现清晰阳性条带为待测标本阳性，否则为阴性。本组扩增产物在相应扩增产物片段处显示清晰阳性条带。
2.3 统计学分析 应用SPSSl5.0统计软件，采用χ2检验及回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 化疗前微转移因子测定 低分化腺癌微转移因子检测总阳性率85%(23/27)，其中hMAM阳性率51.8%，与VEGF和CK19阳性率比较差异有显著性意义(P<0.01);中、高分化腺癌检测总阳性率76%(16/21)。微转移因子阳性率在病理分级中差异无显著性意义(P>0.05)。病理分期Ⅲ期者 微转移因子检测总阳性率87.1%(27/31)，明显高于I～II期的52.9%(9/17)，表明微转移因子与乳腺癌分期有关，即上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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