(pH 7.4)漂洗3×3 min;⑧ 滴加新鲜配置的DAB显色液显色，光镜下控制反应时间(约3～5 min)，自来水冲洗终止反应; ⑨ 苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分色数秒，流水冲洗，0.1%氨水返 蓝;⑩ 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检;用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为阳性对照组。
1.3.3 免疫组织化学结果判断
Ki67蛋白阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞核内。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。
采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对Ki67蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400) ,测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差表示，用SPSS11. 5 软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q) 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
增生期血管瘤内皮细胞胞核内可见密集分布的棕黄色颗粒，Ki67蛋白呈阳性表达;退化期血管瘤内皮细胞胞核内可见少量的棕黄色颗粒，Ki67蛋白呈阴性表达;正常皮肤组织血管内皮细胞胞核内可见少量的棕黄色颗粒，Ki67蛋白表达呈弱阳性。图像分析结果显示: 增生期组Ki67蛋白表达的平均光密度为0.3671±0.0264, 退化期组Ki67蛋白表达的平均光密度为0.0973±0.0062, 正常皮肤组Ki67蛋白表达的平均光密度为0.1578±0.0112; 增生期组Ki67蛋白表达的阳性面积率为0.2983±0.0219, 退化期组Ki67蛋白表达的阳性面积率为0.0764±0.0069, 正常皮肤组Ki67蛋白表达的阳性面积率为0.1058±0.0120,经单因素分析增生期组与退化期组比较(P<0.05)，差异有显著性。退化期组与正常皮肤组比较(P>0.01)，差异无显著性。正常皮肤组与增生期组比较，(P<0.05)，差异有显著性。见表1。表1 血管瘤不同时期Ki67蛋白表达的平均光密度注：增生期组与退化期组比较，* P<0.05; 退化期组与正常皮肤组比较，△P>0.01; 正常皮肤组与增生期组比较，▲P<0.05。
3 讨论
皮肤血管瘤(hemangioma)是婴幼儿较常见的一种良性血管肿瘤，也见于成人。虽然部分个体皮肤的血管瘤可以自行消退，但生长部位特殊以及部分未自行消退的血管瘤具有一定的危险性。如：持续发展的血管瘤可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症;而位于颜面部、颅内及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍;大面积及多发性血管瘤由于占据大量血流可导致高输出性心力衰竭，直接威胁患者的生命。皮肤血管瘤好发于头、面颈，次为四肢和躯干。发生率在新生儿为1.1%～2.6%，约有40%在出生时即可见到，时常在生后2～4周时快速生长。因此对这一部分血管瘤采取何种治疗手段是目前临床及基础研究较为关注的课题。
Ki67属于非组蛋白，对蛋白酶高度敏感，很难分离提取。它的测定是评估人类各种组织增殖组分的可靠和简单的方法，常用Ki67标记指数表示。Ki67抗原的量随细胞周期的不同而发生改变。在G1中期到后期出现表达，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达到高峰。现认为Ki67的功能与染色质相连，与细胞的有丝分裂有关，它可能是具有结合特性重要结构蛋白，在有丝分裂中，起着维持DNA规则结构的重要作用。Ki67的研究多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。Ki67抗原是应用最广泛的增殖细胞标记之一[7～10]。
Ki67是存在于细胞核中能影响细胞增殖的一种蛋白质,为细胞增殖及DNA合成所必需,是反映细胞增殖活性的一个良好的辅助指标。Ki67抗原在有丝分裂期的G1、S、G2期和M期均有合成,但在G0期缺失,由于半衰期短,可以准确的反映细胞的增殖活性,是一个较理想的反映肿瘤细胞增殖活性标志物,明显优于PCNA指数,DNA倍含量等表示细胞增殖的指标,细胞增殖活性的增高与肿瘤的发生发展及恶性程度有关,肿瘤恶性程度越高Ki67蛋白表达水平越高, 肿瘤细胞增殖越快,越易于发生侵袭、转移;故Ki67与肿瘤的预后密切
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