.4.1 实验分组
设对照组(正常培养)、热疗组(单纯加热)、化疗组(单纯DNR处理)和热化疗组(加热联合DNR处理)，热疗组和热化疗组各分别设40 ℃、42 ℃、43 ℃ 3个温度组。
1.4.2 热疗方法
恒温水浴箱中加热60 min，温度变化<0.2 ℃。
1.4.3 DNR工作浓度的确定
DNR设0.025 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.40 μg· mL-1、0.80 μg· mL-1、1.60 μg· mL-1 7个浓度组、每组设4个复孔，MTT法检测细胞增殖抑制率，以作用48 h抑制50%(IC50)的浓度作为工作浓度。
1.4.4 MTT法检测细胞增殖抑制率
取对数生长的KG1a细胞，按每孔200 μL 1×104个/孔铺到96孔培养板中，设只加培养液的孔为空白对照组，分别给予热疗、化疗及热化疗处理，然后培养48 h，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h，3 000 r·min-1离心5 min，吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，全自动酶标仪上选490 nm波长测定各孔的吸光度(optical density difference，OD)值，计算细胞增殖抑制率。实验重复3次，取平均值。细胞增殖抑制率=(对照组OD平均值各实验组OD平均值)/(对照组OD平均值-空白对照组OD平均值)×100%。
1.4.5 克隆形成能力的测定
分别取对照组、42 ℃热疗组、化疗组及42 ℃热化疗组细胞置于甲基纤维素培养体系中，使最终体系含细胞2×103·mL-1、质量分数0.9%甲基纤维素、RPMI1640培养基(含体积分数20%的胎牛血清)。每孔0.5 mL培养体系加入24孔培养板中。每组设4个复孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2的孵箱中培养，第14天于倒置相差显微镜下计数细胞集落数，拍照，以>30个细胞的细胞团为1个集落，并计算各组的集落形成率。集落形成率=平均每孔的集落数/1 000×100%。
1.4.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
取对数生长的KG1a细胞接种于50 mL的培养瓶中，每瓶1×106个细胞，分别按对照组、42 ℃热疗组、化疗组及42 ℃热化疗组处理后放入培养箱中培养48 h，收集细胞，PBS洗涤2次，体积分数75%冷乙醇固定细胞，加入300 μL DNA 染液，混匀，室温避光30 min，每管再加入400 μL缓冲液混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。
1.5 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件进行处理。数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，均数之间多重比较采用LSD法和Dunnett法，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DNR实验工作浓度 MTT测得0.025 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、0.80 μg·mL-1、1.60 μg·mL-1药物浓度对KG1a的抑制率分别为(10.90±2.92)%、(16.63±3.05)%、(29.86±4.24)%、(49.62±2.47) %、(63.61±3.73)%、(85.67±5.37)%、(92.74±5.81)%，通过IC50软件计算出IC50约为0.20 μg·mL-1。
2.2 细胞增殖抑制率
40 ℃、42 ℃、43 ℃热疗60 min对KG1a均有抑制作用(P<0.05)，抑制作用随温度增高而增强;化疗组对KG1a 也有明显抑制作用;热化疗组在40 ℃、42 ℃、43 ℃温度下，对KG1a均有显著的抑制作用(P<0.05)，随着温度的增高而增强。3种温度的热化疗组与化疗组及相同温度热疗组相比有显著性差异(P<0.05)。见表1。
2.3 克隆集落形成率
甲基纤维素培养体系中培养14 d后，对照组的细胞克隆集落形成率为(60.50±4.33)%，42 ℃热疗组为(36.17±3.03)%，化疗组为(29.87±3.41)%，42 ℃热化疗组为(14.72±2.84)%，42 ℃热疗组、化疗组、42 ℃热化疗组均低于对照组(P<0.05)，热化疗组明显低于化疗组及热疗组(P<0.05)。见图1。
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