克霉唑药膜微生物限度检查方法的验证试验研究

4.2 为消除药物对敏感菌的抑菌活性，采用离心加与薄膜过滤法对2种敏感菌进行了方法条件的选择。

白色念珠菌1∶10、1∶50供试液10 ml经500 r/min离心4 min，膜法冲洗300 ml，回收率为0%、8%；取上清液1 ml室温冲洗300 ml、500 ml、800 ml，均无回收。

冲洗液温度对白色念珠菌回收的影响：由于克霉唑难溶于水，膜法过滤冲洗液温度较低时，药物及辅料溶解不充分截留于膜上药物不能冲洗干净，1∶10供试液上清液0.25 ml试验结果无回收；将冲洗液温度加热提高至40~45 ℃冲洗，取上清液0.25 ml、0.2 ml冲洗500 ml回收率均能达70%以上；结合表3对3个批号样品的验证试验结果，该法能有效消除药物对白色念珠菌抗菌活性，回收率均能达70%以上，重现性好。

枯草芽孢杆菌1∶10、1∶100、1∶200 3种供试液试验结果：前2种回收均达不到70%；1∶200供试液可消除其抑菌活性，回收率达70%以上；结合表3对3个批号样品的验证试验结果，该法能有效消除药物对枯草芽孢杆菌抗菌活性，回收率均能达70%以上。

4.3 稀释剂对照组结果：与试验组同法，白色念珠菌、枯草芽孢杆菌在离心加薄膜过滤及冲洗条件下基本不受影响，回收率均能达到70%以上。

4.4 控制菌金黄色葡萄球菌检查方法验证：3个批号验证试验结果均能检出金黄色葡萄球菌，阴性菌对照组结果显示方法专属性好（表4）；表4结果显示铜绿假单胞菌检查方法可按CP2005年版二部附录微生物限度检查法规定的方法检查。

4.5 根据试验研究的结果，建立克霉唑药膜微生物限度检查方法 细菌计数：取 1∶200的供试液10 ml于500 r/min离心5 min，取全部上清液加至装有约90 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，过滤，60 ml/次，冲洗5次，共300 ml；其它操作按CP2005年版二部微生物限度检查法薄膜过滤法。霉菌、酵母菌计数：取 1∶10的供试液10 ml于500 r/min离心4 min，取出全部上清液混匀作为供试液，取 0.25 ml加至装有约100 ml 45 ℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，过滤，用45℃冲洗液冲洗6次，80~90 ml/次，共500 ml，作4个膜（取样量共1 ml）；其它操作按CP2005年版二部附录微生物限度检查法薄膜过滤法。

计数结果计算：Ｘ=A×K。 Ｘ：菌数（cfu/10 cm2）；A细：营养琼脂平板膜上的菌落数或菌落平均数 ；A霉菌、酵母菌：4个玫瑰红钠琼脂平板膜上的菌落总数 ；K：稀释倍数，K细=20，K霉、酵=10。

控制菌检查：铜绿假单胞菌，取1∶10供试液10 ml，按CP2005年版二部微生物限度检查法相应方法检查；金黄色葡萄球菌，取1∶10供试液10 ml，500 r/min离心5 min,取全部上清液，加至装有约90 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的滤器中，过滤，冲洗3次，100 ml/次，取膜加至相应的增菌培养基100 ml中，以下操作按CP2005年版二部微生物限度检查法中相应方法检查。

以上建立的方法能有效的控制该药品质量，可作为克霉唑药膜的微生物限度检查方法。

【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典2005年版二部附录[S].北京： 化学工业出版社， 2005：93.

[2] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京：中国医药科技出版社，2005：325.

[3] 刘鹏，马仕洪.加替沙星微生物限度检查方法的建立[J] .药物分析杂志，2007（6）：881-884.
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