克霉唑药膜微生物限度检查方法的验证试验研究

2.3.3 冲洗方法条件选择 采用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每个滤器60、80~90 ml/次，冲洗量 300 ml、500 ml或800 ml，在最后一次冲洗液中加试验菌液，冲洗液温度为室温、40~45 ℃，按冲洗效果进行选择。

2.4 控制菌检查验证试验

2.4.1 铜绿假单胞菌 取1∶10供试液10 ml，按CP2005年版二部附录微生物限度检查法中铜绿假单胞菌规定的相应方法进行验证。

2.4.2 金黄色葡萄球菌 取1∶10供试液10 ml 500 r/min，离心5 min，取全部上清液加至装有约80 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的滤器中按薄膜过滤法过滤，冲洗3次，100 ml/次，取膜加至相应的增菌培养基100 ml中，以下操作按CP2005年版二部附录微生物限度检查法中金黄色葡萄球菌检查的相应方法进行验证。

3 结果

3.1 敏感菌确定及细菌、霉菌及酵母菌计数方法选择试验

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌用平皿稀释法1∶10供试液，每皿1 ml，前3种细菌的回收率分别为97%、65%、89%，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌无回收，大肠埃希菌、黑曲霉回收率均达到70%以上；每皿0.2 ml金黄色葡萄球菌回收率为118%；枯草芽孢杆菌、白色念珠菌也无回收，因此确定为敏感菌。用低速离心沉淀处理供试液与薄膜过滤法联用消除克霉唑抑菌活性，枯草芽孢杆菌500 r/ min离心5 min，薄膜过滤，冲洗300 ml，取供试液10 ml（浓度1∶10、1∶100、1∶200），回收率分别为0、52%、95%，1∶200可达70%以上；白色念珠菌500 r/ min离心4 min，薄膜过滤。结果见表1。表1 敏感菌确定及消除抑菌活性方法选择试验结果（回收率%）
3.2 验证试验结果

3.2.1 大肠埃希菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌验证结果 前2种试验菌采用平皿法，每皿加入1∶10供试液1 ml；金黄色葡萄球菌用平皿稀释法，每皿加入1∶10供试液0.2 ml，作3个批号样品回收试验，结果见表2。

3.2.2 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌验证结果

根据方法选择结果，枯草芽孢杆菌验证方法采用离心沉淀处理供试液与薄膜过滤法联用，取1∶200供试液10 ml，500 r/min离心5 min，取全部上清液 表2 大肠埃希菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌验证试验结果(cfu) 注：空白组均为o cfu

加入约90 ml冲洗液中，过滤，60 ml/次冲洗5次，共300 ml，作3个批号样品，结果见表3。

白色念珠菌验证：根据选择结果，离心沉淀处理供试液，用薄膜过滤，冲洗液温度提高至40~45 ℃，冲洗，上清液0.25 ml、0.2 ml冲洗500 ml，回收均能达70%以上。取1∶10供试液10 ml，500 r/min,离心4 min，全部上清液混匀，取0.25 ml过滤，40~45 ℃冲洗液每次80~90 ml冲洗6次，共 500 ml，3个批号样品分别作回收试验，平行作2个 膜，结果见表3。 表3 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌离心加薄膜滤法验证试验结果注：空白组均为o cfu

3.2.3 稀释剂对照组 由于2种敏感菌计数方法采用离心、薄膜过滤、冲洗，为考察供试液中微生物受影响的程度，作稀释剂对照组回收试验。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入试验菌，浓度为50~100 cfu/10 ml；取10 ml与试验组同法离心加薄膜过滤、冲洗，取膜贴于规定的琼脂培养基，测定菌数，为试验组；不作离心加薄膜过滤、冲洗为菌液组，计算回收率，结果均能达到70%以上。

3.2.4 控制菌检查验证试验 结果见表4。表4 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌验证试验结果注：BL增菌液为100 ml； ：生长相应典型菌落或阳性反应； —：无菌生长或阴性反应

4 讨论

4.1 克霉唑为抗真菌药，按CP2005年版规定的验证菌株为试验菌分别作回收，从本组结果看出，平皿稀释法白色念珠

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