含何首乌血清对人胚肺二倍体成纤维细胞端粒酶活性的影响

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 2BS由北京生物制品研究所提供的25代细胞系，以30代龄以下为年轻细胞，50代龄以上为老年细胞。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品， SOD检测试剂由南京建成生物技术有限公司提供，Trizol试剂盒为美国Invitrogen公司产品，RT-PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物为上海生物工程公司合成，Telomerase PCR-ELISA试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。KHB K3酶标仪(芬兰)，2700型PCR仪(ABI公司，USA)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 含药血清制备[3] 取健康家兔6只(由右江民族医学院动物实验中心提供)，随机分为空白对照组和用药组。用药组每天灌胃何首乌水煎剂(含生药)4.5g/kg，空白对照组灌胃蒸馏水，连续灌胃5天，采血前24h禁食，采血前再灌胃1次，每只家兔采血于无菌离心管中离心10min(3000r/min)，无菌分离血清，56℃灭活30min，过滤除菌，冻存备用。

　　1.2.2 细胞培养及分组 将2BS细胞于25ml培养瓶中培养，以含100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞分组为：年轻组、空白血清对照组(简称对照组)和含何首乌药物血清组(简称用药组)。年轻组从25代开始用10% FBS的RPMI 1640培养液培养，传代至30代时收集细胞;取生长状态良好的35代细胞，消化传代，待细胞贴壁后，吸弃含FBS的培养液，换10%含药血清培养液，即含药血清组，同时换空白血清做对照，传代至51代后，收集细胞。

　　1.2.3 SOD活性测定 分别收集各组细胞，调整细胞数为1×106/ml，细胞反复冻融，使细胞胀破，离心取上清液用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，于550nm处测OD值。实验过程参照检测试剂盒说明书。

　　1.2.4 半定量RT-PCR检测基因表达 离心收集各组细胞，按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA。内对照β-actin和c-myc引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证。β-actin引物：上游5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3′，下游5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′，扩增产物长度621bp;c-myc引物：上游5′-CCA ACA GGA GCT ATG ACC TC-3′，下游5′-CTC GGT CAC CAT CTC CAG CT-3′，扩增产物为290bp片段。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50μl，逆转录45℃×45min，禽成髓性白血病病毒逆转录酶(AMV RT)灭活和预变性94℃×2min，然后进行PCR 35个循环(94℃×30s，57℃×1min，68℃×2min)，最后延伸68℃×7min，终止于4℃。各取PCR产物10μl，加溴酚蓝指示剂2μl，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1h(电压90V)，用紫外透射分析仪观察结果。通过密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以β-actin的表达量为对照计算并比较各组c-myc的相对表达量。实验重复3次。

　　1.2.5 端粒酶活性检测 离心收集各组细胞。制备端粒酶抽提液和端粒重复序列扩增法-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)操作按照试剂盒说明书进行。以690nm作为参比波长，测定样品在450nm波长的吸光度(A)，吸光度差值△A=A450nm-A690nm，△A值代表细胞端粒酶活性。

　　1.2.6 统计方法 计量数据以±s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，参数统计采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 各组2BS细胞SOD活性的检测结果 年轻组2BS细胞SOD活性明显高于对照组(P<0.05)，用药组2BS细胞SOD活性明显高于对照组(P<0.001)，见表1。

　　表1 各组2BS细胞SOD活性比较(略)

　　注:与对照组比较,a:t=4.093,P<0.05;b:t=8.122,P<0.001

　　2.2 各组2BS细胞c-myc mRNA的表达 各组2BS细胞c-myc mRNA相对表达量无明显变化(P>0.05

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页