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急性脊髓损伤后脊髓组织内皮素 |
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ET-1在继发性脊髓损伤中的作用机制。
材料与方法
1. 实验动物分组:健康雄性SD大鼠60只,体重（350±20）g，随机均分为10组 ：正常组；对照组（单纯行T8～10椎板切除）；脊髓损伤后0.5，2，4，8，12，24，48，72 h组。
2. 损伤模型的制备及取材：采用Nystrom等［1］法从后路压迫脊髓：用质量浓度为60 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg/kg)，分离、咬除T8～10椎板，暴露出T8～9，保持硬脊膜完整。固定两端棘突。通过一2.2 mm×5 mm弧形金属垫片压迫T8～9脊髓后侧，压迫重量为35 g，时间5 min，造成脊髓中度损伤。取材：按分组时间将大鼠麻醉后开胸，行胸主动脉插管灌注。先灌注50 ml灭菌等渗盐水，然后灌注250 ml质量浓度为40 g/L的多聚甲醛和3 g/L的饱和苦味酸混合液，维持20 min后完整取出脊髓组织，后固定6～12 h。再入质量浓度为200 g/L的蔗糖和40 g/L的多聚甲醛混合液中脱水。伤段脊髓行连续冠状切片，厚50 μm，固定4～6 h。
3. 原位杂交：(1)探针合成:将含有大鼠ET-1cDNA序列编码区的质粒PCR 1000 (Yanagisawa博士馈赠)转化入HB101大肠杆菌(Promega公司，美国)后大量扩增，经EcoRⅠ酶切后制成线性DNA模板。采用T7 RNA聚合酶(Promega公司)体外转录，RNA地高辛随机引物标记盒（Boehringen Mannheim公司，美国）标记制成反义ET-1 cRNA探针。(2)原位杂交:采用飘染法。①切片预处理:切片依次入下列溶液漂洗:0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS) 5 min×3次，0.1 mol/L甘氨酸/PBS 5 min，质量浓度为4 g/L的 Triton X-100/ 0.1 mol/L PBS 15 min，1 μg/ml蛋白酶K 37℃水浴30 min，质量浓度为40 g/L的多聚甲醛PBS 5 min，0.1 mol/L PBS 3 min×2次，质量浓度为2.5 g/L的乙酸酐 10 min，2×SSC 10 min。②杂交及显色:切片用灭菌滤纸吸干后入杂交液中（探针含量0.5 μg/ml），43℃杂交12～16 h。将切片依次挑入4×SSC、2×SSC（含RNA酶 A，20 μg/ml）、1×SSC、0.5×SSC 37℃漂洗15 min，再入0.05 mol/L PBS漂洗5 min×3次。吸干后入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(1∶1 000)稀释液中，室温放置4 h。用0.05 mol/L PBS冲洗5 min×4次，TSM1 15 min×2次，TSM2 25 min×2次。最后入硝基四氮唑蓝(NBT)和5-嗅，4-嗅，3-吲哚基-磷酸(BCIP)显色液中，室温避光显色3 h。常规贴片封片。
4. 结果判定及统计学处理：ET-1 mRNA杂交阳性细胞胞浆内含有紫蓝色颗粒。每组任选10张切片，计算机图像分析仪(中国科学院自动化研究所)上由未知实验细节者计算脊髓前角阳性颗粒灰度和面积。所有数据用±表示，采用t检验行统计学处理。
结 果
正常组、对照组T7～8灰质神经元胞浆内可见淡紫蓝色阳性颗粒。前角Ⅸ区大多极神经元胞浆内着色较深。后角Ⅰ～Ⅲ区未见阳性细胞。Ⅳ～Ⅵ区及中央管周围Ⅹ区见中等量杂交阳性神经元。在非神经元细胞，包括胶质细胞和星形细胞，未见阳性信号。白质中无着色。灰质中偶见阳性血管内皮细胞表达。见图1，2。损伤组T7～8灰质中ET-1 mRNA表达明显增多，主要表现为数目增多，着色变深。非神经元细胞及白质中未见阳性表达，后角Ⅰ～Ⅲ区见少量阳性细胞表达。损伤后0.5 h即有明显表达增多，主要表现在前角（Ⅸ区）。见图3，4。经统计学处理，前角阳性颗粒灰度和面积与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。见表1。损伤后4 h ET-1 mRNA表达达高峰(P<0.01)，48 h仍有明显升高(P<0.05)，至72 h趋于正常水平。正常组与对照组比较无明显差异。
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