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成鼠胸髓损伤后延迟植入雪旺细胞与胚胎脊髓细胞混悬液 |
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mmunoreative for MBP, 5－HT positive nerve fibers were relatively abundant in SCS plus FSCS grafts.There was no neurite in DMEM grafts. Conclusion SCS cultured from adult rat peripheral nerves was able to promote spinal axonal regeneration and to construct the myelin sheath, the mixed grafts could stimulate regrowing axons derived from some supraspinal neurons regenerate into the grafts at the thoracic level in the adult rat spinalcord.
【Key words】 Spinal cord injuries Cells Transplantation Histology
目前许多学者确信，中枢神经系统（central nervous system，CNS）再生能力受限极可能为不适宜的生长环境而非损伤的轴索本身不具有再生能力所致。80年代，一些学者将周围神经（peripheral nerve，PN）段植入成鼠脊髓，观察到中枢轴索在PN移植物中可生长一定距离[1]。SC为PN的主要成分，对经去除SC处理和未经此处理的PN移植比较发现，仅未经处理有SC的PN移植可使受损CNS区的轴索长入PN中[2]。大量实验研究已证实SC的产物可影响离体和在体的神经元或轴索的存活和/或轴索的生长。因此一些学者视SC及其产物为支持中枢轴索再生长入PN中的基本条件。胚胎脊髓移植已显示出桥梁、中继及营救受损脊髓神经元的作用[3]。
材料与方法
一、移植物的制备
(一)SCS的制备：采用特异粘附法制备SCS。将由Wistar大鼠坐骨神经消化获得的细胞悬液，经两次30分钟孵育后，吸取未贴壁的细胞进行培养。培养增殖1周后，加入乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminotetraacetic acid,EDTA）吹打收集于离心管中。经离心冲洗后，加入适量DMEM(0.1ml/管)吹打制备成SCS。移植前经台盼蓝染色，细胞记数为(1.8～2)×106个/ml，存活率90％～95％。将盖玻片上生长的单层细胞经S－100蛋白染色，以鉴定SC纯度。镜下观察，80％以上细胞为S－100蛋白阳性(记数300个细胞)，且表现出SC的形态特点，胞体细长、双极，常呈肩并肩或端对端生长(图1)。
图1 培养的SC，S－100阳性，胞体细长，肩并肩，端对端生长 PAP×200
(二)FSCS的制备：E14孕鼠乙醚麻醉，剖开子宫，选头臀长11～13mm者7～8个，剥离出脊髓切碎成1～2mm3块，收集于小烧杯中。加入适量DMEM（0.5ml）轻轻吹打成悬液，200目钢网过滤即制成FSCS。移植前经台盼蓝染色，细胞记数为(2～3)×106个/ml，存活率95％。
(三)SCS＋FSCS的制备:将上述制备的SCS与FSCS按体积1∶2混合即制成SCS＋FSCS混合悬液。移植前经台盼蓝染色，细胞记数为2.5×106个/ml，存活率93％。
二、实验动物分组
35只雌性Wistar大鼠，体重230～250g，经后路切除T7椎板，应用改良Allen法（10g×4cm）打击脊髓，关闭伤口。实验分四组：第1组为单纯脊髓损伤（SCI）组5只，第2、3、4组各10只于伤后1周采用显微注射，分别植入DMEM、SCS、SCS＋FSCS各15μl。
三、取材与观察
所有动物除SCI组于术后1周，其它3组于术后2、6周各5只，均行10％中性甲醛心脏灌注切取T4～10椎板相应脊髓固定于10％甲醛中。脊髓标本常规石蜡包埋，纵行6μm切片，HE嗜银染色行组织学观察。免疫组化检查，MBP染色观察移植物中的SC和髓鞘，5－HT染色观察下行运动神经纤维；NF染色观察移植物中的神经元。
结果
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