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培养大鼠脑皮层神经元损伤后c |
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加以改良如下:无菌分离15～18天胎龄SD胎鼠的大脑皮层,用0.125%的胰蛋白酶消化37℃、20分钟,用含血清的培养液终止消化,制备成细胞数为5×104/ml的细胞悬液,接种于直径为35mm的培养皿中预先放置的涂有多聚赖氨酸的盖玻片上。培养液为含有15%小牛血清的DMEM(Gibco公司),置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,隔日换液,培养10～12天待细胞成熟后进行实验。
二、损伤方法
1.谷氨酸导致的神经元损伤。根据文献［2］所述方法并稍加改良。培养10～12天的皮层神经细胞,用含1mmol/L谷氨酸(Victor公司)的培养液作用20分钟,然后去除含谷氨酸的培养液,用无谷氨酸的培养液洗涤后继续培养,分别于1,2,4,6小时用4℃、4%多聚甲醛固定30分钟。
2.损伤培养神经元方法。根据文献［3］的方法并稍加改良:用无菌注射针头机械性划破培养细胞的全层,在20mm×20mm玻片上纵横平行分别施行8条损伤径路,用DMEM洗涤后,加正常培养液继续培养,分别于1,2,4,6小时用上述方法固定。对照组不施加损伤因素,只用DMEM洗涤固定方法同上。
三、免疫组化双重标记方法
1.c-fos蛋白免疫组化染色。固定后的盖玻片用0.01mol/L PBS洗涤,然后加0.3%Triton X-100PBS作用15分钟,再用2%正常兔血清孵育20分钟,加兔抗c-fos蛋白抗体(1∶800),4℃过夜。采用链霉亲和素-生物素(SP)法进行免疫组化反应(c-fos抗体和SPKit均购自北京中山生物技术公司)。用一抗孵育的细胞洗涤后,分别经IgG/Biotin室温2小时,HRP/SP室温2小时,最后用GDN法［4］呈色,c-fos蛋白在细胞核内呈紫黑色的圆形颗粒。
2.用NSE抗体标记神经元胞浆和突起。第一次呈色反应完毕后,用PBS冲洗玻片,2%正常兔血清封闭非特异性抗原,然后加兔抗NSE抗体(1∶2 000 Sino-American Biochemistry Co),4℃过夜。然后再分别和IgG/Biotin、HRP/SP反应,用AEC法(AEC Kit购自华美公司)或普通DAB呈色法呈色,神经元胞体和突起被染成红色(AEC法)或棕色(DAB法)。
结 果
一、谷氨酸导致的培养神经元c-fos蛋白表达
1.谷氨酸作用后2小时,细胞开始出现c-fos蛋白表达,c-fos蛋白在胞核中出现,但尚未浓聚,中间尚可见淡染的区域,表明c-fos蛋白正在由胞浆向胞核转运。另外还发现一独特现象,在少数神经元突起的远端也出现c-fos蛋白阳性反应颗粒。
2.谷氨酸作用后4小时,可见c-fos蛋白颗粒明显聚集,密度增高,表达量增加(图3)。3.谷氨酸作用后6小时,可见大量神经元突起开始出现崩解,但c-fos蛋白未见明显消失,有些神经元胞体大部分崩解后,c-fos蛋白颗粒却依然存在(图4)。未行双重标记的神经元,不能分辨胞体和突起。在对照组神经元中无明显c-fos蛋白表达。
图3 谷氨酸作用后4小时,在突起中可见c-fos阳性反应颗粒。
c-fos-GDN法呈色、NSE-AEC法呈色双重标记 ×400
图4 谷氨酸作用后6小时,神经元开始崩解,c-fos蛋白颗粒尚未消失。
c-fos-GDN法呈色,NSE-DAB法呈色双重标记 ×400
二、创伤导致的培养神经元c-fos蛋白表达
1.创伤后2小时,创道周围的神经元有明显c-fos阳性表达,而远离创道未直接损伤的中心部位则无明显c-fos蛋白表达(图1)。
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