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严重烧伤早期中性粒细胞在肝脏中的聚集机制及参与肝脏损害的研究 |
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】 Burns Neutrophil Adhesive force P-selectin Intercellular adhesion molecule-1
严重烧伤后早期中性粒细胞在肝脏中的聚集、滞留,是加重肝细胞损伤的主要因素。笔者进行载体及体外细胞复合培养,动态观察了烧伤病人(面积50%以上、Ⅱ～Ⅲ度)血清对肝细胞和中性粒细胞间粘附力的影响,P-选择素和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在两种细胞中表达的影响,以期探讨中性粒细胞在肝脏中的聚集机制及其对肝细胞的损伤。
材料与方法
1.大鼠烧伤模型制作:选用健康Wistar大鼠25只,体重(250±330)g,随机分为正常对照组(鼠数=5)和烧伤组(鼠数=20),设4个时相点(2,6,12,24小时),每时相点5只,烧伤组用本所常规方法造成30%TBSAⅢ度烧伤(病理切片证实),伤后腹腔注射等渗盐水0.04ml/g体重抗休克,正常对照组除不烧伤外,其他处理相同。
2.肝组织中髓过氧化物酶(MPO)测定:见参考文献［1］,单位10μmol.s－1.L－1。
3.形态学观察:在烧伤后以上时相点取肝脏各一块,苏木素和伊红(HE)染色后观测。
4.人肝细胞和窦状内皮细胞的培养:见参考文献［2］,以2×105/ml接种于六孔培养板中,在37℃,5%CO2孵箱内培养,肝细胞培养4天,肝窦内皮细胞培养8天开始实验。
5.人烧伤血清的获得:50%以上Ⅱ～Ⅲ度烧伤病人,伤后48小时内抽血分离血清,56℃、30分钟灭活补体制成20%的烧伤血清1640合成培养液。
6.中性粒细胞的分离纯化:在开始实验前2小时抽正常人血,用等量的淋巴细胞分离液离心4000～6 000g 30分钟取中层中性粒细胞,用梯度浓度溶解残留的红细胞,纯化中性粒细胞,涂片染色证实为中性粒细胞,其纯度和存活率大于95%。
7.肝细胞和中性粒细胞粘附力的测定:培养4天完全附壁于培养腔的肝细胞,放入已分离纯化的中性粒细胞,分正常对照组和烧伤血清作用组,以孵育1,2,6,12,24小时运用微管吸吮系统测定将中性粒细胞从肝细胞上拉开的拉力,用公式Fa=△P×πRP2(其中Fa:粘附力,△P:100×mm H2O,Rp:微管的直径)计算粘附力。
8.肝细胞、肝窦内皮细胞中P-选择素和ICAM-1表达的检测(流式细胞术):将培养4天的肝细胞和培养8天的肝窦内皮细胞分成两组,即正常对照组(不加烧伤血清)和实验组(加入烧伤血清),设1,2,6,12,24小时五个时相点,用胶原酶消化2～3分钟,将附壁的细胞游离,用PBS液离心清洗,加入适当稀释的P-选择素单抗(苏州医学院血栓病研究所)和ICAM-1单抗(德国宝灵曼公司),在4℃冰箱中孵育30分钟,PBS液清洗后加入相应的荧光抗体,在4℃冰箱中孵育30分钟,PBS清洗后上机检测。
9.统计学处理:以均值±标准误(±s)表示,采用t检验。
结 果
1.烧伤后大鼠肝脏中MPO活性的变化(表1)。
表1 30%TBSAⅢ度烧伤大鼠肝脏中MPO活性的变化(μmol.s－1.L－1,±s)(鼠数=5)
烧伤后时间(h) 0 2 6 12 24
MPO活性 0.13±0.03
0.25±0.08**
0.32±0.11**
0.23±0.07**
0.29±0.12**
与烧伤前(正常对照)比较,**P<0.01
2.光镜显示:从6小时开始至24小时检测的三个时相点肝组织中荻氏间隙增宽,并可见大量的中性粒细胞和单核细胞进入其中。
3.烧伤血清对肝细胞和中性粒细胞粘附力的影响(表2)。
表2 烧伤血清对培养的人肝细胞和中性粒细胞粘附力的影响(mN×10－6,±s)(鼠数=10)
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