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老年大鼠骨痂中转化生长因子 |
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gG，复合消化液，SABC试剂盒为武汉博士德公司产品。其它试剂均采用分析纯。
1．3 组织学观察 切片经脱蜡至水、HE染色后，进行组织学观察。
1．4 免疫组化染色 切片经脱蜡至水后，分别经0.3%双氧水封闭内源酶。按常规ABC法进行免疫组化染色，即切片经一抗（TGF-β1多克隆抗体）处理过夜后，依次经生物素化第二抗体、ABC复合物处理，DAB显色。苏木精复染。脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，用试剂盒内阳性切片作阳性对照。阳性细胞浆和(或)膜着色呈棕黄色。
2 结果
2．1 术后系列组织学观察 术后1周骨折断端血肿内可见新生的肉芽组织，并有毛细血管长入，间充质细胞较多。术后2周，肉芽组织机化，软骨岛出现。术后4周，新生软骨增多，出现少量成骨细胞，并以软骨内成骨的方式形成网织骨。术后8周，大量骨小梁开始形成，小梁间隙内有丰富的毛细血管。仍可见许多肥大的软骨细胞。术后12周，有成熟板层骨形成，髓腔再通。
2．2 免疫组化 术后1周断端间的软组织血肿为阳性着色。术后2周阳性细胞主要是纤维组织内的成纤维样间充质细胞和软骨细胞（图1）。术后4周，软骨细胞及周围基质阳性着色（图2）。术后8周，成骨细胞及周围的类骨质为阳性着色，肥大的软骨细胞染色阴性（图3）。术后12周，成熟板层骨中的成骨细胞周围基质为阴性反应。
3 讨论
骨折愈合涉及一系列不同的细胞活动。而这些细胞功能又与多种生长因子有关。TGF-β1是一种对多种类型结缔组织细胞具有复杂生物学效应的生长因子，具有调节骨修复的作用。在骨组织中，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞都可以分泌TGF-β1，骨组织中TGF-β1的浓度是其它组织的100倍〔2〕。在骨折修复的不同阶段其基因表达水平不同。Bolander等〔3〕认为，在非老年性骨折愈合过程中，TGF-β1在早期就有表达，但水平较低，即使用Northern-blot法，也很难检测到。而在骨折后2～4周即有软骨生成且软骨内成骨阶段表达水平达到高峰，此时成熟的软骨细胞、成骨细胞TGF-β1染色为强阳性，其后表达水平逐渐下降至正常。而在老年性骨折愈合过程中，由于其软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等的功能都有不同程度的改变，因此TGF-β1的表达也有其相应的特点。
本实验结果发现：(1)骨折后早期 即术后1周断端内的肉芽组织染色阳性，说明老年大鼠骨折后早期血肿内基质有TGF-β1表达。由于此时骨折断端血肿内主要是一些间充质细胞和血小板，因此TGF-β1除来源于血小板外，还来自于间充质细胞的分泌。术后2周间充质细胞染色阳性，也说明骨折后早期分泌TGF-β1的主要是间充质细胞。直到4周时，间充质细胞逐渐消失，软骨细胞才大量分泌TGF-β1。(2)骨折修复的第二阶段即软骨内成骨期，TGF-β1主要来源于软骨细胞分泌。术后2周，幼稚的软骨细胞出现TGF-β1阳性染色，开始分泌TGF-β1，4周时达到高峰。8周时软骨细胞则开始肥大，停止分泌TGF-β1，而成骨细胞开始分泌TGF-β1。随后成骨细胞功能开始下降，12周时成骨细胞着色阴性，仅剩周围基质内仍有TGF-β1表达。(3)成骨细胞功能有明显下降。整个骨折修复期，仅在8周时见成骨细胞内表达TGF-β1,而在非老年性骨折愈合过程中，从早期的软骨内成骨阶段，到后期的软骨骨化阶段，成骨细胞都分泌TGF-β1，免疫组织化学染色也呈阳性〔4〕。在本实验中，尽管新生成的类骨质阳性表达，但成骨细胞TGF-β1阳性表达较少，分泌的TGF-β1量较少，很难检测到。说明老年大鼠成骨细胞功能有明显下降，这可能与增龄导致的成骨细胞分泌功能降低有关。(4)软骨生成及软骨内成骨期明显延长。本研究发现，老龄大鼠骨折后8周，骨痂内仍可见大量的软骨细胞，这与一般的骨折愈合过程相比，软骨内成骨期明显延长。体外实验发现，TGF-β1可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞并刺激Ⅱ型胶原和软骨糖蛋白的合成〔1〕。Joyce等〔5〕认为软骨内成骨时，新生骨区的TGF-β1主要由成骨细胞分泌。老年大鼠成骨细胞功能减退使TGF-β1的表达水平降低，影响了Ⅱ型胶原和软骨糖蛋白的合成，导致软骨向骨转变延迟。
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