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IFN |
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al of the growth factor family but also the signal of IFN- γ to delay wound healing.
Key words:Signal Transduction; Wound healing; Protein tyro sine kinase; IFN-γ
参与伤口修复的细胞通过自分泌和/或旁分泌多种生物活性物质如生长因子等调节自身或其 它细胞的增殖、分化、凋亡、移动和合成多种物质如各种因子和细胞外基质等功能，共同完 成伤口的修复过程。多种生长因子在修复的早期刺激细胞增殖和物质合成，后期还调节细胞 的凋亡、移出和释放分解胶原等细胞外基质的酶类，参与瘢痕组织的改建和塑形等瘢痕成熟 过程。已经证实，生长因子家族的刺激信号经其受体PTK［1］活化转递。而IFN- γ刺激信号经JAKs-STATs(Janus Kinase-Signal Transducer and Activator of Transcrip tion)传导［2～3］，JAKs也具有酪氨酸激酶活性。创伤愈合期IFN-γ对伤口周 边组织和肉芽组织中PTK活性的影响未见报告，我们进行了检测。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 leupeptin、aprotanin、AEB SF和氟化钠购自sigma公司；(γ-32p)ATP(3000ci/m mol)购自北京亚辉生物公司； 重组兔IFN-γ和PTK检测kit购自Promega公司；蛋白质定量试剂购自Bio-RAD公司；Beckman GS-15R冷冻高速离心机；Polytron超声匀浆仪；Beckman LS 6500液闪仪；Perkin Elmer Lambda 14紫外可见光分光光度计等。
1.2 创面形成和用药方法 健康家兔（体重2.0～2 .5kg）5只，雌雄不限。3%戊巴比妥钠1.5～1.8ml静脉注射麻醉，耳腹侧做1.0cm×1.0cm大 小创面，间隔1.0cm，深度达耳软骨膜，左右各6处，共60个创面。处理侧每日用IFN-γ溶液 （1000 U/ml）换药，对照侧使用生理盐水，直到伤口愈合。伤后1天、3天、6天、12～16 天(上皮化时)收集创面肉芽组织（伤后1天时肉芽组织很少，不取材）和创周3mm 内组织（ 深度与创伤一致），迅速置液氮中冻存。
1.3 PTK活性测定 按kit的说明进行。简而言之，按1∶10（W/V）比例加入样品缓冲液于组织中，匀浆 。14000g离心5min，留上清液作为酶样，按每一反应含0.5mM ATP 1μl、γ-32pAT P(3000ci/m mol) 0.05μl和去离子水1.45μl，准备ATP混合物。以上操作均在0～4℃进 行。
反应总体积为25μl。每次反应加PTK测定5x缓冲液5μl、PTK多肽底物12.5μl、1mM 矾酸钠2.5μl、100mM DTT 2.5μl、γ-32pATP混合物2.5μl和去离子水5μl，空白 反应用PTK稀释缓冲液代替酶样，混匀。30℃温育5min, 加酶样5μl启动反应，准确30℃温 育15min（温育时间、酶样要否稀释和PTK底物选择均由预实验确定），加12.5μl终止缓冲 液终止反应。每样品均为双复管。点反应混合液12.5μl到SAM2TM膜。依次用2M NaCl 、含1%磷酸的2M NaCl和去离水洗膜，总时间约12～15min；另外，任取两个反应液各5μl点 到SAM2TM膜但不洗，所有膜均在室温干燥，液闪计数膜的放射活度。
按Bio-RAD公司的去污剂蛋白质含量法测定总蛋白质含量，除对照组外，样品用血液分析仪 测定血红蛋白含量，总蛋白质含量减去血红蛋白含量即为组织蛋白含量(如公式)。
计算公式：
cpm无酶样的计数平均值为920.47。γ-32pATP的特异 活性=（37.5/5）x/2500=2202.933cpm/p mol(x为未洗膜的平均每分钟计数值)，本次实 验测得146862.20。
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