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纤溶酶原激活剂及其抑制因子1在大鼠脊髓急性损伤时的表达 |
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胞外蛋白降解酶的作用，纤溶成分的改变等。笔者着重就纤溶成分中的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活剂抑制因子(PAI－1)在脊髓急性损伤时表达的变化及作用进行探讨。
材料与方法
一、 脊髓急性损伤模型的制作
取成年健康Wistar大鼠35只，体重250～300 g，雌雄不限，随机分为6组，每组5只。用质量浓度为3 g/L的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉（1.0 ml/100 g），手术区脱毛，固定。消毒后显露胸腰段椎板，咬除T12～L1椎板，显露硬脊膜。在T13腰骶膨大处放置一直径3 mm、重0.1 g的铜片。用10 g法码，在直径为1 cm玻璃管的引导下从6 cm高处垂直落下打击铜片，冲量为60 gcf，致大鼠脊髓中度损伤。伤后2，6，24，168，240小时再次麻醉后，分别用等渗盐水和质量浓度为40 g/L的多聚甲醛心脏灌流，以打击点为中心取约1 cm长的伤段脊髓，放入质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定液中，4℃固定约8小时，连续切片，分别行HE染色、免疫组化检查。
二、 免疫组化染色及图像分析
鼠抗t-PA和PAI-1单抗为上海医科大学分子遗传研究室惠赠；ABC复合物购于华美公司。采用ABC法，按照说明中的提示进行免疫组化染色，分别以家兔血清或PBS取代第1抗体作替代对照或空白对照。
在MIAS－300图像分析系统上，分别测定一定面积中的阳性信号面积和阳性信号平均灰度值，每例测4个高倍视野，计算免疫组化阳性指数（PI）［3］。
结 果
一、 HE染色观察
脊髓损伤后2小时灰质内散在出血，6小时白质、灰质内灶性出血，灰质肿胀；24小时灰白质内片状出血，神经轴突浊肿变性，神经元固缩、变性、坏死、溶解，神经元间隙增大；7天神经元数量明显减少，残存神经元尼氏体开始增加，神经胶质细胞开始增多；10天脊髓灰质开始出现萎缩，神经纤维排列紊乱，胶质细胞较7天时无明显增多。
二、 免疫组化染色观察
正常大鼠胸腰段脊髓t-PA抗原呈弱阳性，且主要位于脊髓灰质和软脊膜，而PAI－1无明显表达，脊髓损伤2小时后t-PA免疫组化染色阳性反应逐渐增强，3天时达到高峰（图1）；以后又有所转弱，3天时软脊膜染色呈明显阳性，着色亦较深。PAI－1在脊髓损伤3天内免疫组化无染色，3天时略有染色（图2），以后逐渐深染，成局灶性，前角运动神经元、胶质细胞7天时明显深染（图3）。免疫组化对照切片无着色。
图1 脊髓损伤后3天前角运动神经元及胶质细胞
t-PA抗原强阳性反应 免疫组化 ×200
图2 脊髓损伤后3天前角运动神经元及胶质细胞
PAI-1抗原微弱阳性反应 免疫组化 ×400
图3 脊髓损伤后7天前角运动神经元及胶质细胞明显减少，
PAI-1抗原强阳性反应 免疫组化 ×200
t-PA与PAI－1免疫组化阳性指数（PI）随时间变化：脊髓损伤后72小时t-PA表达达到高峰，以后逐渐下降；PAI－1在伤后72小时有少量表达，以后逐渐增多，至168小时达到高峰，然后逐渐下降（图4）。
图4 t-PA与PAI-1免疫组化阳性指数(PI)的变化
讨 论
t-PA和PAI－1是纤溶系统中重要的调节因子，t-PA可激活纤溶酶原使其变化为纤溶酶，而PAI－1可抑制t-PA活性，对t-PA具有调节作用，从而影响整个纤溶系统。
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