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c and serum TNF-α, IL-6 expression and production in endotoxemia mouse.
【Key Words】 Interleukin-10 Gene therapy Interleukin-6 Tumor necrosis factor-α Endotoxemia
治疗基因表达的组织、时序及水平的严格调控是任何基因治疗进入临床前必需解决的问题，而如何有效地调控转染的外源性细胞因子基因则决定了其基因治疗的价值及应用范围［1］。白细胞介素10(IL-10)又名“细胞因子合成抑制因子（CSIF）”，其广泛抑制多种炎症介质的合成, IL-10 已经应用于脓毒症及SIRS的抗介质治疗、移植排斥反应、哮喘及慢性炎症疾病等综合治疗的临床研究［2］，但半衰期过短是其主要问题之一。笔者探索IL-10基因治疗方法及调控治疗基因IL-10表达的全新策略，拟应用急性相蛋白血清淀粉样蛋白A3 （SAA3）启动子调控IL-10表达，使IL-10表达呈炎症诱导及自适应表达特性［3］。在内毒素攻击模型观察pSAA3 HIL-10诱导表达体系在小鼠的炎症诱导表达及IL-10基因转染对TNF-α、IL-6表达的抑制作用。
材料与方法
一、材料
1.动物：昆明种小鼠, 18～25 g, 6～8周龄，本校实验动物中心提供。
2.主要试剂：DNA抽提药盒、 DOTap脂质体转染试剂盒、RNA抽提药盒，Titan RT-PCR药盒，人特异性IL-10 ELISA kit ( Boehringmannheim 公司）；RNA酶抑制剂、逆转录酶AMV等为Promega公司产品 ; LPS（E.coli O111 B4， Sigma公司）；HIL10 引物合成（中科院上海生理所生工公司）；TNF-a测定用ELISA 药盒（军事医学科学院邦定公司提供）；IL-6 ELISA 药盒（第四军医大学提供）。
3.表达载体：真核表达载体pSAA3HIL-10本室构建［3］，全长4.5kb, 含小鼠SAA3的启动子/增强子 (-306～+47)调节序列其下游为HIL-10 cDNA完整的编码区及信号肽。
二、方法
1. 动物分组：小鼠随机分3组: PSAA3 HIL-10基因转染组、单纯LPS攻击组（LPS 250 μg/只）及基因转染联合LPS攻击组（LPS 250 μg/只）。
2.pSAA3HIL10基因的体内导入：脂质体／DNA复合物准备：溶液A, 取75 μg pSAA3 HIL10质粒DNA, 用HEPE缓冲液稀释至100 μl, 溶液B, 取100 μl DOTap脂质体，混合A、B溶液，轻轻摇匀，室温静止置10～25分钟。脂质体腹腔转染：常规消毒腹部，取上述混合液200 μl及300 μl等渗盐水，腹腔注射。
3. 基因转染后处理：基因转染组转染后动物恢复正常饮食，基因转染联合LPS攻击组，48小时后腹腔注射250 μg LPS，小鼠LPS攻击后不同时间（6，24，48，72，96，120，144小时）取眼眶血，处死小鼠取肝、脾、肺、肾标本液氮保存。
4.HIL10表达测定：用人特异性IL-10 ELISA kit测定；用人特异性IL-10抗体常规做脏器免疫组织化学分析。
5. HIL10 表达RT-PCR分析： 用RNA抽提药盒抽提细胞总RNA，HIL10 引物， P1:5 -CTGAAGACTTTCTTTCAAACA
AA G-3 ，P2: 3 -CTGCTCCACTGCCTTGCTCTTATT-5 ；RT-PCR扩增反应条件：首先55℃反转录30分钟,94℃变性30秒，55℃复性45秒，68℃延长2分钟，共30～35循环,首轮循环94℃变性2分钟，最后一轮68℃延长10分钟。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳观察。
6.TNF-а测定：常规ELISA药盒测定。
7.IL-6测定：常规ELISA药盒测定。
8.数据处理: 数据以均数±标准差表示。用EXCEL软件和SPSS统计程序包进行方差分析及t检验。
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