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冷冻同种异体肌腱小鼠移植的细胞毒 IL 2水平及组织学观察 |
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Corning公司)，液氮储存容器,显微手术器械,全自动酶免分析仪(美国Auraflex公司)。
二、溶液
1.试剂：Hanks液，体积分数为10％的新生小牛血清(FCS)，RPMI1640培养液,PHA溶液,淋巴细胞分离液,兔补体,医用液体石蜡，质量浓度为83 g/L的Tris－NH4Cl液，酸化异丙醇，质量浓度为50 g/L的伊红水溶液，MTT染色液。
2.CTIL－2细胞株(华西医科大学免疫教研室赠)。
3.淋巴细胞悬液制备：取C57小鼠的脾脏,用100目不锈钢筛研磨制成单个细胞悬液，用质量浓度为83 g/L的Tris-NH4Cl除去红细胞。提取细胞悬液5 ml,加入1/2的淋巴细胞分离液,离心2 000 r/min 15分钟,再用体积分数为10％的FCS－RPMI1640将细胞浓度调至2×106/ml，置4℃冰箱备用。
4.局部组织匀浆上清制备：无菌条件下取植入局部组织块50mg左右，加入不完全RPMI1640培养液,用100目不锈钢筛研磨，离心，体积分数为10％的FCS－RPMI1640培养液调至细胞浓度2×106/ml，加PHA，37.5℃、体积分数为5％的CO2培养48小时，收集上清，－20℃冻存。
三、供体肌腱的处理
取C57近交系雄性小鼠(华西医科大学实验动物中心提供)50只，体重20g左右,断颈处死，在严格无菌条件下，切取双侧跟腱共100根，Hanks液(加庆大霉素100U/ml)反复冲洗后,低温保护剂DMSO及体积分数为10％的FCS浸泡10分钟，放入消毒玻瓶中待处理。
1.冷冻组：放入可控低温冰箱(下降1℃/h)降温至－80℃10天后，或再移至液氮储存器保存－196℃待用，分别制成－80℃和－196℃组，术前15分钟解冻。
2.冻干组：放入可控低温冰箱10天后，再置入真空冷冻干燥机处理至残余湿度1％左右，密封，术前3小时解冻。
四、动物模型及分组
取6～8周雄性BALB/C近交系小鼠90只，体重20g左右，随机分为5组，戊巴比妥钠腹腔麻醉，在小鼠双侧股后肌间隙分别植入冻干组(A)、深冷冻组(B)、冷冻组(C)、未经处理组(D)、自体移植腱组(E),术后2，7，14，28，42天无菌条件下取血清、局部组织块及组织匀浆上清液待用。
五、检测方法及步骤
1.微量细胞毒测定：采用Terasaki改良法［1］ 。在微量反应盒每孔加入5～10μl医用石蜡油，以防反应物蒸发，加入待检各组的受检血清1μl；加入细胞浓度为2×106 /ml的淋巴细胞悬液1 μl，轻轻振动，使血清与细胞充分混匀，另设阴性与阳性对照孔；置室温(22±2)℃30分钟；加入兔补体5 μl，置室温(22±2)℃60分钟；加入质量浓度为50 g/L的伊红溶液3 μl染色；加入体积分数为3％的甲醛8μl固定；静置2小时，轻轻吸去上清液，倒置相差显微镜下计数。死细胞(伊红染色)百分数按高于对照孔计算。
2.IL-2活性测定：采用细胞增殖MTT比色法［1］。将处于对数生长IL－2依赖细胞株CTIL-2用体积分数为10％的FCS－RPMI1640洗涤3次,离心，用体积分数为5％的FCS－RPMI1640调整细胞浓度为1×105 /ml,加入96孔反应板中,每孔100 μl;加入局部组织匀浆上清100 μl/孔；每份样品作复孔,另外作阳性(rIL－2标准)及阴性(培养液)对照；37.5℃、体积分数为5％的CO2培养24小时；加质量浓度为50 μg/L MTT溶液10 μl/孔；继续培养24～36小时；加酸化异丙醇100 μl/孔；充分振荡吹打后，静置20分钟，用检测波长570 nm参考波长630 nm比色分析。
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