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烧伤焦痂毒性物质D1对大鼠肝线粒体H ATP酶活性及能量偶联的影响 |
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ticles H+-transporting ATP synthase Fluorophotometry
大面积烧伤产生的焦痂有时因客观上的种种原因，不能及时除去。焦痂中含有多种有毒性的物质，其中烧伤焦痂中提出的毒性物质D1能抑制鼠肝线粒体呼吸功能［1］，损害线粒体呼吸链的复合物Ⅲ节段［2］，增加线粒体膜的通透性，并使线粒体膜的跨膜电位电压下降［3］。笔者观察D1对H+转运ATP酶活性及能量偶联的影响。
材料与方法
1． 动物：Wistar成年大鼠，雌雄不拘，体重(200±20)g，由本校动物室提供。
2．试剂：三磷酸腺苷（ATP），1－苯胺基－8－萘磺酸镁（ANS）为Sigma公司产品，其余试剂皆为国产分析纯。
3．仪器：Beckman J-21型高速低温离心机（美国）；日立55P－72型超速低温离心机（日本）；Beckman DU－7紫外／可见光分光光度计（美国），日立MPF－4型荧光分光光度计（日本）及SHG－1型生物化学发光测量仪（上海）。
4．鼠肝亚线粒体的制备［4，5］：断头处死大鼠，取出肝脏，在2℃分离介质（0.25 mol/L蔗糖，pH7.4）内剪碎并洗数次以除去残留的血液。将洗净的肝组织加预冷的分离介质在玻璃匀浆器中研磨数次，500×g离心6分钟 。取上清液以10 000×g离心10分钟。以预冷的分离介质洗涤沉淀物，10 000×g离心10分钟。复以分离介质悬浮沉淀，在冰浴中超声处理（185W，每次10 s，共4次）。超声处理后，10 000×g离心10分钟。取上清液以105 000×g离心45分钟，以分离介质悬浮沉淀，定蛋白含量，悬浮液中所含的蛋白即为亚线粒体颗粒（SMP）。
5．D1的制备见参考文献［1］。
6．H＋－ATP酶水解活力的测定［6］：在0.25 ml, 0.1 mol/L Tris (pH7.5)介质中加入SMP0.1 ml (1 mg/ml)，再分别加入D1100，75,50，25，12μl (1mg/ml)。30℃保温2 分钟，以0.25 ml ATP混合液（含0.004 mol/L MgCl2, 0.02 mol/L, ATP, 0.1 mol/L Tris, pH7.5）启动反应，在30℃水浴中保温10分钟，以20％三氯醋酸0.25 ml终止反应。1 000×g离心10分钟。取上清液0.25 ml加重蒸馏水1 ml，混匀，再加入1.5 ml显色剂（含10％抗坏血酸，2.5%钼酸铵，6 Eq/L硫酸及重蒸馏水，按1∶1∶1∶2临用时配制），充分震荡混匀。45℃水浴10分钟，在DU－7分光光度计上710 nm处读吸光度值。查对磷（Pi）标准曲线，可得无机磷含量，酶活力单位以μmol.mg-1.min-1表示。
7．线粒体ATP含量测定：取新鲜制备的SMP，分别加入D1100，75，50，15，12 μl（1 mg/ml），30℃保温5 分钟用荧光发光法测ATP含量。ATP荧光发光测定试剂盒（ATP biolumin cence, HS kit）购于Boehringer Mannhem公司（德国），测定程序按试剂盒操作说明进行。
8．ANS荧光强度的测定：在2.8 ml 0.1 mol/L Tris (pH7.5)介质中加入0.1ml SMP（6 mg/ml）再分别加入D1 (l mg/ml) 100，75，50，25，12 μl。30℃保温5分钟，加入20μl ANS 1 mmol/L。 震荡混匀2分钟,加入50μl ATP－MgCl2混合液0.1 mol／L。在MPF－4型荧光分光光度计上测定荧光强度。激发波长375 nm，发射波长440 nm，狭缝5 nm。荧光相对强度为测得的荧光值减去MP，ANS及D1单独测定时各荧光强度之修正值。
9．统计处理：各组均值之间的差异用t检验，用直线回归法发析D1剂量与观察指标间的相关关系。
结 果
1. H＋－ATP酶水解活力的变化：表1显示D1作用于亚线粒体颗粒后ATP水解酶的活力变化：正常亚线粒体颗粒ATP水解酶的活力(7.18±0.06)μmol.mg-1.min-1。加入D1后，ATP酶活力下降，其下降的程度与D1的剂量呈负相关（r=-0.9990）。
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