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脂多糖刺激肺血管内巨噬细胞环氧合酶 |
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r macrophage, PIM）为位于肺泡壁毛细血管腔内的肺内单核/巨噬细胞成员之一［1］，吞噬、分泌功能非常活跃。Bertram等［2］曾发现，PIM可经环氧合酶（cyclooxygenase，COX）代谢花生四烯酸（arcachidonic acid，AA），释放AA代谢产物（AAM）等炎症介质。Wilbom等［3］报告COX有两型，其中COX-1起生理调节作用； COX-2为诱导型，在脂多糖（LPS）等的刺激下，可大量释放AAM，在机体的炎症反应中起重要作用；并发现肺泡巨噬细胞有COX-2表达。但PIM是否同时存在两型COX，并在急性肺损伤（ALI）等急性炎症性疾病中发挥作用,报道甚少。笔者报告LPS刺激猪PIM后，其COX-2 mRNA和酶蛋白表达量及COX-2活性的改变，进而探讨ALI的发病机制。
材料与方法
1. 猪PIM的分离、培养：按李胜亮等［4］报告的方法，并行下列改良：一是开胸后不取出心肺，行原位肺灌洗；二是含氯化钙的灌洗液临用前才配制，避免沉淀物影响肺血管灌洗。
2. 实验分组及标本收集 ： 吹打下经常规培养2 h后的猪（重庆地区杂种猪）PIM。分为对照组：PIM在无血清的RPMI 1640（Sigma公司，美国）中培养; LPS组：向培养基中加入10 μg/ml 的LPS （escherichia coli serotype 055:B5，Sigma公司，美国）以刺激细胞。检测COX-2 mRNA表达时，收集刺激后0.5,1,2,4,6和8 h 的细胞待测；观察酶蛋白表达和前列腺素E2(PGE2)含量时，则增加12，16，20和24 h 等时相点。
3．COX-2 mRNA检测：用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法。用总RNA提取试剂盒(宝灵曼公司，德国)，一步热酚法提取细胞总RNA。取总RNA 1 μg ，65℃变性5 min，依次加入0.5 μg oligo-dT15（Promega公司，美国），4 μl 5×RT-PCR合成酶缓冲液（systhese buffer，含Mg2+ 2.5 mmol/L）（Promega公司，美国），0.125 mmol/L dNTP,10 U反转录酶（AMV）,0.01 mmol/L DTT, 40 U RNAase抑制剂，总体积为20 μl。42℃孵育60 min，95℃ 10 min 终止反应,完成cDNA第一链的合成。PCR时， COX-2寡核苷酸引物合成根据Lee等［5］的设计合成。 正义引物：5′-ACTCACTCAGTTTGTTGAGTCATTC-3′。 反义引物：5′-TTTGATTAGTACTGTAGGGTTAATG-3′，用这对引物可特异性扩增出583 bp的COX-2 cDNA序列。为进行质控，每次行RT-PCR时，都对应扩增次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT）作为外对照。HPRT寡核苷酸引物根据Osawa等［6］的设计合成。正义引物：5′-GCTGGTGAAAAGGACCTCTCG-3′， 反义引物：5′-GCAGATGGCCACAGGACTAGA-3′。用这对引物可特异性扩增出258 bp 的HPRT cDNA序列。取1 μl反转录反应液，分别加入5 μl 10×PCR缓冲液 ，1.75 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP,0.4 μmol/L COX-2或HPRT寡核苷酸引物，5个单位 Taq DNA聚合酶，总反应体积为50 μl，一式三管。PCR反应所需变性、退火和延伸温度分别为94℃，55℃和72℃，反应时间均为1 min，共循环30次。首次94℃下循环需2 min。反应完成后取5 μl PCR反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。以PCR maker为分子量标准，对电泳黑白照片进行密度扫描，测其积分吸光度值。
4． COX-2酶蛋白的检测：采用链霉抗生素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-peroxidase conjugated method ）［7］。取刺激后0.5，1，2，4，6，8，12，16，20和24 h的细胞 ，加羊抗鼠COX-2多克隆抗体（一抗，中山公司）,4℃过夜；再加生物素标记兔抗山羊IgG（二抗，中山公司），37℃温育0.5 h,DAB显色5 min。阴性对照时一抗用0.01 mol/L PBS代替。染色后光镜下作定性观察，在图像分析系统上作定量分析。在每帧图像上随机取10个细胞的积分吸光度值代表免疫反应强度。上一页 [1] [2] [3] 下一页
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