ansferase mediated nick end labeling,TUNEL)及免疫组化染色方法，比较治疗组与创伤组、对照组之间损伤脑组织中神经细胞凋亡状态及相关蛋白Bcl2和Bax的表达，探讨白藜芦醇对颅脑损伤后神经细胞凋亡的影响，进一步了解白藜芦醇对颅脑损伤的保护作用，以期获得高效、低毒、价廉的潜在性临床药物。
材料与方法
1 实验动物与分组
健康成年雄性SD大鼠75只，体重(250±30)g，购于第四军医大学医学实验动物中心。随机分为：(1)治疗组：改良Feeney自由落体脑损伤装置致伤动物，给予白藜芦醇(50mg/kg)腹腔注射治疗，于伤前1天治疗1次，伤后每天治疗1次，直至动物处死;(2)对照组：同法致伤动物，给予等量生理盐液腹腔注射治疗;(3)外伤组：同法致伤动物不予治疗，伤后自由喂养。每组根据伤后处死时间点不同，再分为3、12、24、48、72小时组，共5个亚组，各亚组每组动物5只。
2 试剂及仪器
Res购于西安华萃生物技术公司，使用前以生理盐液稀释至浓度为2%;TUNEL试剂盒，兔抗大鼠Bc12及Bax试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司;DAB购于Sigma公司;山羊抗兔IG及正常山羊血清购于北京中杉金桥生物技术有限公司;SABC试剂盒购自福建迈新生物公司;其他试剂均为分析纯，实验室自备;恒冷冰冻切片机(德国Leica公司)，光学显微镜(BX60，日本Olympus公司)。
3 实验方法
所有动物用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，剪去大鼠头部毛发固定大鼠，矢状正中切开头皮，暴露顶部，于右侧中线旁2mm、冠状缝后4mm处，牙科钻钻一直径约5mm骨窗，保持硬膜完整，骨蜡止血。直接采用自由落体颅脑损伤模型制作方法(改良Feeney法[2]，击锤重20g，底面直径约4mm,30cm高处自由落体致伤右额顶骨窗部，造成局灶性脑损伤模型)，缝合头皮，消毒后放回笼内饲养，正常喂食水(死亡者剔除)。按实验设计给予Res处理，分别在规定时间点深麻醉(>40mg/kg,i.p)动物后迅速开胸经左心室至升主动脉插管，剪开右心耳，以150ml生理盐水冲洗，随后用4℃含4%多聚甲醛的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)先快后慢灌流固定2小时，取脑置于20%蔗糖中过夜，次日取伤区脑组织经PBS洗涤后用恒冷切片机连续冠状切片，片厚30μm，分组置于PBS中存放，部分伤区脑组织制作石蜡切片。
4 TUNEL染色法
取一组切片，按博士德公司的TUNEL检测试剂盒操作说明进行：切片用4%多聚甲醛/0.1mol/L PBS(pH 7.0～7.6)室温固定，PBS漂洗;3%H2O2室温处理，蒸馏水洗;标本片加Proteinase K 37℃消化，PBS漂洗;加标记液，置于湿盒中，37℃标记2小时，PBS漂洗;加封闭液：生物素化抗地高辛抗体加至标本片上，置于湿盒中，37℃反应，PBS漂洗;加SABC至切片，37℃反应，PBS漂洗;DAB显色，苏木素轻度复染，PBS漂洗;脱水，透明，封片，显微镜下观察。
5 Bcl2和Bax免疫组织化学方法
各取一组切片，在相同条件下按博士德公司的兔抗大鼠Bc12及Bax试剂盒及福建迈新生物公司SABC试剂盒操作说明进行。切片在0.01mol/L PBS中漂洗后，入含0.3%Triton X100的0.01mol/L PBS中室温浸泡30分钟，微波抗原修复,然后：(1)分别入兔抗大鼠Bc12及Bax抗体稀释液(1：100)，室温孵育24小时;(2)生物素标记相应种属抗体(1：200)室温放置2小时;(3)生物素卵白素HRP复合物(SABC，1：500) 室温浸泡2小时,然后用葡萄糖氧化酶DAB法呈色，阳性产物为细胞浆中有棕黄色颗粒者，结束染色的切片经漂洗后脱水、透明，中性树脂封片，显微镜下观察。
6 结果观察和图像采集
光镜下(BX60，Olympus，Japan)观察切片并应用软件(Mivnt图像分析系统，Germany) 在×40目镜下计数阳性细胞率。计数方法：每张切片取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞中阳性细胞数，取平均值代表该张切片阳性细胞率，同法记数各时间点切片的阳性细胞数，总平均数代表该时间点的阳性细胞率，均以百分比表示。TUNEL阳性结果用凋亡指数(apoptosis index，AI)表示，Bcl2和Bax免疫反应的结果用平均阳性率(percentage,P)表示。
7 统计学处理
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