S，Hyclone)，2mmol/L L谷氨酰胺(Sigma)，0.6%葡萄糖，DMEM/F12培养基(Hyclone)，多聚赖氨酸，0.25%胰蛋白酶 (Sigma)，10mmol/L Lleucinemethylester(Sigma)，0.15mmol/L EDTA，Hanks液(自备)，兔抗大鼠IgG(GFAP,Sigma)，小鼠抗大鼠IgG(NF200,Sigma)，羊抗小鼠TRITC(IgG荧光控制体，北京中山公司)，0.4%TritonX100，甲醇，30%H2O2，0.01M PBS(北京中山公司)。
3 实验方法
3.1 PAS的培养 新生2天的SD大鼠，无菌条件下剔除软脑膜及血管，取大脑皮层组织，剪碎，0.25%胰蛋白酶37℃消化30分钟，培养液(10%胎牛血清，2mmol/L L谷氨酰胺，0.6%葡萄糖，DMEM) 吹打成细胞悬液，接种于培养瓶，孵育30分钟，翻转瓶子吸出细胞悬液，接种于涂有多聚赖氨酸的培养瓶中，密度为1×106个/ml，孵箱中培养，每3～5天换液1次。培养至14天后，向培养基中加入10mmol/L Lleucinemethylester并孵育1小时以杀死小胶质细胞，用新鲜培养基洗2次，孵育2小时，37℃摇床上以180r/min振荡16小时，O2A前体细胞被摇起，瓶中所剩的一层即为PAS。
3.2 PAS的鉴定
固定PAS细胞，用0.5%H2O2/甲醇灭活内源性过氧化物酶，0.4%TritonX100孵育，滴加正常山羊血清封闭，加入GFAP抗体37℃孵育2小时，羊抗小鼠TRITC荧光抗体IgG显色后DPX封片，激光共聚焦显微镜观察，激发波长为543nm，呈红色。
3.3 NSC的培养和鉴定 参见刘媛等[2]建立的方法。
3.4 NSC和PAS共培养
3.4.1 分组 根据NSC与PAS的比例分为4组：3:1组;2:1组;1:1组;1:2组，共培养10天。
3.4.2 NSC分化情况鉴定 经DAPI标记的NSC分化10天后，用NF200对分化神经元进行标记，用TRITC显色，方法同3.2部分。激光共聚焦显微镜观察，激发波长为543nm阳性细胞，呈红色。DAPI标记为蓝色，激发波长为380nm。
3.4 统计学处理 在显微镜下随机选取20个视野，每次计数100个细胞，计算神经元在NSC中所占的比例。实验数据用SPSS 10.0软件处理，结果以±s表示，组间差异采用单因素方差分析。
结果
1 PAS的鉴定结果分析
PAS外观扁平，胞体较大，折光性好，突起宽而扁，似荷包蛋样，分支较少(见图1)。
2 NSC与PAS共培养后分化比例分析
结果观察到NSC:PAS 2:1组分化得到的神经元数量最多，与分化的胶质细胞比例为65%:35%;而1:1组、3:1组稍低一些，比例分别为61%:39%和59%:41%;1:2组比例最低为57%:43%(见表1，图2、3)。
表1 神经干细胞与原浆型星形胶质细胞以不同比例共培养后的分化情况(略)
与2：1组比较：##P<0.01;与1：1组比较：△△P<0.01
图1 PAS组化鉴定共聚焦显微镜观察(GFAP红色荧光标记，胞体较大，圆盘状，突起宽而扁，分支少，形似绒球)(略)
图2 神经干细胞与原浆型星形胶质细胞以不同比例共培养后的分化情况(略)
a.NSC:PAS 3:1时分化神经元染色( ×100);b.NSC:PAS 2:1时分化神经元染色( ×100);c.NSC:PAS 1:1时分化神经元染色( ×100);d.NSC:PAS 1:2时分化神经元染色( ×100);DAPI(蓝色)标记NSC核;NF200(红色)标记神经元;B组分化神经元比例最高
图3 NSC与PAS在不同比例下共培养10天神经元分化的情况(略)
讨论
星型胶质细胞(astrocyte，AS)能分泌多种细胞因子，调控NSC分化，在神经发育及损伤再生中具有重要作用[3,4]，分为PAS和FAS两种类型。本室已在实验中观察到PAS比FAS更有利于NSC向神经元的分化[1]，但NSC与PAS以什么样的比例共培养才能更有利于NSC向神经元分化，进而满足脊髓损伤修复的要求?因此，筛选出NSC与PAS的最佳比例显得尤为重要。本实验结果显示，NSC:PAS比例为2:1时分化
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