褪黑素对重症急性胰腺炎的保护作用

　　采用Trizol法提取总RNA，参照RT-PCR试剂盒(MBI)的说明反转录成cDNA，PCR引物由大连TaKaRa公司设计。引物序列：①GAPDH：上游引物GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG;下游引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，②Smac/DIABLO：上游引物GACACTGTGCGCCGTTCCTA;下游引物GAGGTGCTGTCCGTTACCAAAGA，③XIAP：上游引物TGAGGTTCTGATTGCAGATCTTGTG;下游引物CTTGTAGGCGCCTTAGCTGCTC。循环设置：95℃ 10 min变性;95℃ 30 s;60℃ 30 s;72℃ 45 s;循环40次。反应完成后，得到所有标本的曲线，软件自动进行数据分析，调整基线，计算出 Threshold Cycle(Ct值)。每个标本均做3次重复，取其均数。反应完成后再于95℃ 15 s;60℃ 1 min;95℃ 15 s;得融解曲线。

　　1.7 Smac/DIABLO、XIAP mRNA计量方法 根据Livak和schmittgen[1]设计的阈值法测定目的基因的相对表达，目的基因量=2-△△Ct(△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组)。将所有样本组织管家基因GAPDH、Smac/DIABLO以及XIAP的Ct值带入公式计算得出各样本组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA相对表达量。

　　1.8 统计学方法 所有数据以x±s表示，进行正态性检验和方差齐性分析，采用t检验、完全随机设计单因素方差分析、SNK-q检验。

　　2 结果

　　2.1 胰腺组织学改变 显微镜下，SO组各时间点胰腺组织小叶清晰，未见明显异常;SAP组3 h胰腺间质水肿，伴少量炎细胞浸润;6 h后胰腺间质水肿，出血，炎细胞浸润明显增加;12 h严重出血，见中性粒细胞和单核细胞浸润。MS组各时点与SAP组相应时点比较，胰腺组织病理损伤均明显减轻。

　　2.2 胰腺组织细胞凋亡情况　 SO组细胞凋亡指数各时点之间差异无统计学意义(P>0.05);SAP组细胞凋亡指数各时点均较SO组相应时点增加，各时点差异有统计学意义(P<0.05);MT组各时点细胞凋亡均较SAP组相应时点降低，差异有统计学意义(P<0.05)。(表1，图1)

　　2.3 大鼠胰腺组织Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达 管家基因GAPDH、Smac/DIABLO以及XIAP分别在18-21、25-28、27-31循环时进入指数扩增期。

　　Smac/DIABLO mRNA的表达 MS组与SAP组表达水平以SO组为参照。Smac/DIABLO mRNA表达在SAP组各时点随时间延长而减少，差异有统计学意义(P<0.05)，MS组各时点均较SAP组相应时点降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

　　XIAP mRNA的表达 MS组与SAP组表达水平以SO组为参照。XIAP mRNA 表达在SAP组各时点随时间延长而增多，差异有统计学意义(P<0.05)，MS组各时点均较SAP组相应时点增多，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

　　3 讨论

　　MT为一种小分子的脂溶性物质，是现知最强的抗氧化剂，其易通过解剖生理屏障进入亚细胞，可在细胞膜、细胞浆及细胞核中发挥作用，在急性胰腺炎中的研究受到广泛的关注。MT可通过MT受体、细胞因子等发挥抗凋亡作用，其抗凋亡的机制包括调节死亡受体途径和线粒体途径中多种分子的表达等，它的这些作用可能与它的线粒体生理学有关[2]。

　　本实验应用MT 50 mg/kg在制造大鼠SAP模型前30 min预处理SAP大鼠，随着时间延长MS组较SAP组相应时间点胰腺组织病理损伤减轻，表明MT预处理SAP可改善胰腺组织损伤，对SAP具有保护作用。

　　有研究表明，MT通过线粒体途径调节细胞凋亡，Han YX等[3]等在神经元缺血再灌注损伤中研究结果表明，MT能减少DNA损伤，抑制线粒体释放细胞色素C和凋亡蛋白酶caspase-3的激活，阻止缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)缺失引起的线粒体膜电位改变，说明在缺血再灌注中MT通过线粒体途径调节凋亡。Gülben K[4]等研究MT在急性胰腺炎中的作用时指

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