褪黑素对重症急性胰腺炎的保护作用

　　Key words melatonin; acute pancreatitis; cell apoptosis; Smac/DIABLO; X-linked inhibitor of apoptosis protein

　　褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的神经内分泌激素，通过MT受体、细胞因子等发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡以及基因调节作用。大多数研究认为，褪黑素在急性胰腺炎中的保护作用是通过它的抗氧化，清除自由基等发挥作用，而对褪黑素通过调控凋亡通路来发挥抗凋亡、保护胰腺腺泡细胞的作用的研究甚少。X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)可通过抑制半胱天冬蛋白酶-3、-7及-9(caspase-3、-7、-9，)发挥抗凋亡作用，其作用受到多种相关因子的负性调控。第二个线粒体源的半胱天冬蛋白酶激活物/直接与凋亡抑制蛋白结合的低等电点蛋白(second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI，Smac/DIABLO)是多种负性调控蛋白的一种，通过与XIAP的结合，拮抗XIAP对caspase的抑制，发挥促凋亡作用。本实验旨在脱氧胆酸钠诱导的大鼠重症急性胰腺炎模型中，观察应用MT干预后胰腺组织细胞凋亡、病理组织改变及Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达，探讨MT在急性胰腺炎保护作用中的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组 健康SD雄性大鼠54只，体质量200~250 g，由温州医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分成3组：假手术组(SO)、重症急性胰腺炎(SAP)组和褪黑素干预SAP组(MS)，每组各18只。

　　1.2 实验材料 紫外分光光度仪;实时定量PCR仪(ABI);褪黑素(Ruibio)：先用无水乙醇溶解，再加0.9%氯化钠注射液稀释，使乙醇浓度小于2%;脱氧胆酸钠(Sigma);Trizol(Invitrogen);First strand cDNA synthesis kit(MBI);SYBR Green PCR Master Mix(ABI);TUNEL试剂盒(Roche)。

　　1.3 动物模型制备 SD大鼠饲养1周后随机分组，术前12 h禁食不禁水，水合氯醛(5%，1.4 mL/200 g)腹腔内注射麻醉，无菌条件下经大鼠腹正中线入腹，确认胰管，采用20号静脉留置针经对侧的十二指肠插入肠腔，留置针进入十二指肠乳头后拔出内芯，同时在胆管出肝门处用无损伤小动脉夹夹闭，防止注入药物反流入肝脏。SO组仅翻动胰腺几次，SAP组匀速注入3.5%脱氧胆酸钠(0.1 mL/100 g)，MS组在诱导SAP前30 min经腹腔注射MT(50 mg/kg)，常规关腹，动物造模后于背部皮下分点注射2.0 mL无菌生理盐水，补充水分。各组大鼠分别于术后第3、第6、第12 h(各组各时间点6只)经下腔静脉取血5~8 mL，离心、留取上清液，于-20℃保存。并迅速取出胰腺组织平均分成两部分：一部分置于去RNA酶冻存管中，于-80℃保存;一部分经4%的多聚甲醛固定。心脏穿刺取血处死大鼠。SAP组大鼠在造模后6~12 h之间，死亡2只。MT组大鼠在6~12 h之间死亡1只，SO组大鼠全部成活。

　　1.4 胰腺组织病理形态学观察 胰腺组织常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察胰腺组织病理改变。

　　1.5 胰腺组织细胞凋亡检测 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)(按罗氏说明书进行)。石蜡组织切片(多聚赖氨酸处理过的玻片摊片)常规脱蜡，梯度水化，蛋白酶K消化，加TUNEL反应液，碱性磷酸酶抗体，DAB显色，苏木精复染，封片，观察。凋亡的腺泡细胞核内染色体发生断裂而被染成棕黄色，计算5个视野，每个视野中阳性细胞数/总细胞数×100%，即为凋亡指数(apoptosis index，AI)。

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