与βactin扩增带平均灰度值(A)，计算目标产物mRNA表达指数(I)，I=A产物/Aβactin。
1.5 免疫细胞化学法测定MMP2、MMP9及VEGF蛋白表达 6孔细胞培养板每孔放置8mm×8mm盖玻片4个，每孔加入5×105/mL的细胞悬液3mL，待细胞贴壁后，用含不同浓度NE的高糖DMEM培养基干预48h，制成细胞爬片。用SP法对爬片进行染色，严格按照试剂盒说明书进行检测。一抗滴度为1∶200，PBS代替一抗做阴性对照。中性树胶封片后于光镜下观察照相，免疫组化结果用彩色图像分析软件Image Pro Plus进行灰度测量。
1.6 统计学分析 数据结果用±s表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行分析，不同组之间应用单因素方差分析进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 NE对MiaPaCa2细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验结果显示(图1、图2)，随NE浓度增大，MiaPaCa2细胞穿膜细胞数量逐渐增多。与空白对照组相比，1μmol/L和10μmol/L NE处理组穿膜细胞数量明显增多，差异有统计学意义(P<0.01);0.1μmol/L NE处理组与空白对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。
2.2 MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达的变化 RTPCR及半定量分析显示(图1、表1)，1、10μmol/L NE处理组MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达均高于空白对照组(P<0.05)，0.1μmol/L NE处理组与空白对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。且MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达与NE浓度呈剂量依赖性。
2.3 MMP2、MMP9及VEGF蛋白表达的变化 MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9及VEGF的灰度值随NE浓度的增大而降低，表明蛋白的表达量在升高(表2、图4)。与空白对照组相比，1、10μmol/L NE处理组MMP2、MMP9及VEGF表达均有显著性差异(P<0.05);0.1μmol/L NE处理组与空白对照组的差别无统计学意义(P>0.05)。表1 MiaPaCa2细胞的MMP2、MMP9及VEGF mRNA表达表2 不同浓度NE组MiaPaCa2细胞中MMP2、MMP9和VEGF蛋白表达灰度值
3 讨 论
90%的肿瘤病人不是死于原发病灶，而是死于肿瘤的远处转移。肿瘤远处转移的发生目前有两种理论，一种是基于基因突变的理论，它由FEARON和VOGELSTEIN在结肠癌中提出[3]，并随着肿瘤抑制基因MADH4的发现而得到了发展;另一种理论是基于信号物质的发现，比如和G蛋白偶联受体结合的配体物质，研究发现，这些信号物质能够调节肿瘤细胞的主动迁移和侵袭能力。这些配体物质重要包括两类：趋化因子和神经递质[2]。NE是一种经典的神经递质，研究发现，NE能够促进肿瘤细胞的主动迁移和侵袭能力。SOOD等[4]研究发现，NE能够促进卵巢癌细胞的侵袭转移;LANG等[5]在乳腺癌和前列腺癌中也证实了NE能够促进肿瘤细胞侵袭转移的现象。本研究显示：随着NE干预浓度的增加，胰腺癌细胞的侵袭能力逐渐增强，表明NE参与直接调节胰腺癌细胞的侵袭能力，促进胰腺癌细胞的远处转移。
肿瘤细胞侵袭转移的发生，包括粘附基底膜、细胞外基质的溶解、主动迁移和穿过基底膜的过程，其中，肿瘤细胞溶解细胞外基质的能力在肿瘤的侵袭转移中发挥了重要的作用，而间质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是这一过程的关键因子。MMPs可以降解细胞外基质中的胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖类蛋白，从而进一步有利于肿瘤细胞的远处转移。研究发现，MMPs和VEGF在人类多种肿瘤中发生共表达。BELOTTI等[6]发现高水平的VEGF和MMPs在卵巢癌病人中共表达;MUNAUT等[7]发现在胶质母细胞瘤中VEGF的表达与MT1MMP、MMP2和MMP9表达呈正相关;DONY等[8]在人头颈鳞状细胞癌中也发现MMP9与VEGF的表达呈正相关。本研究显示：NE能够调节胰腺癌细胞中MMP2、MMP9和VEGF的表达，呈浓度依赖性。NE上调MMP2、MMP9和VEGF的表达导致了胰腺癌细胞侵袭能力的增强。
我们的研究证实，NE在胰腺癌侵袭转移的发生和发展过程中具有重要作用。NE能够在mRNA和蛋白
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