he expressions of MMP2, MMP9 and VEGF.
KEY WORDS: pancreatic cancer; cell invasiveness; neurotransmitter; norepinephrine
胰腺癌具有侵袭力强、早期即发生转移的特点，5年生存率不足5%，其主要原因是患者在就诊时肿瘤就已经发生了远处转移。肿瘤细胞侵袭能力增强是肿瘤远处转移的先决条件。所以，研究胰腺癌细胞侵袭能力的影响因素对指导临床诊治有重要意义。近年来，肿瘤细胞微环境中的信号物质对肿瘤细胞侵袭能力的影响成为研究的热点，这些信号物质包括趋化因子和神经递质两类[1]。本研究旨在通过观察胰腺癌细胞株MiaPaCa2在不同浓度经典神经递质去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)的干预下侵袭能力的变化，以及细胞中MMP2、MMP9、VEGF mRNA和蛋白表达的变化，探讨NE对胰腺癌细胞侵袭能力的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 胰腺癌细胞株MiaPaCa2由西安交通大学医学院中心实验室提供;高糖DMEM培养基及小牛血清购自Gibco公司;去甲肾上腺素购自Sigma公司;兔抗人MMP2、MMP9、VEGF多克隆抗体购自北京博奥森公司;免疫组化SP试剂盒及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司;总RNA提取试剂盒(RNAfast200)购自上海飞捷生物技术公司;逆转录试剂盒购自MBI公司;PCR试剂盒购自TaKaRa公司;引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;Millicell小室购自美国Millipore公司;Matrigel基质胶及MTS试剂盒购自BD公司;PCR扩增仪为Gene公司产品。
1.2 细胞培养与实验分组 MiaPaCa2细胞用含100mL/L小牛血清的高糖DMEM培养基在37℃，50mL/L CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞，经胰酶消化后制成细胞密度为5×105/mL的细胞悬液，将其接种于细胞培养板，待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入NE浓度为0、0.1、1、10μmol/L的高糖DMEM培养基，实验分为空白对照组、0.1、1、10μmol/L NE组，干预48h后用于随后实验。每孔设3个复孔，实验重复3次。
1.3 Transwell法检测细胞体外侵袭能力 将Millicell小室放入24孔板中，4℃溶解Matrigel基质过夜，稀释后加100μL于上室，37℃孵育4h使Matrigel基质凝固，下室加入600μL含100mL/L小牛血清的DMEM培养基。经去甲肾上腺素干预后的MiaPaCa2细胞，经胰酶消化后用无血清培养基制成1×105/mL细胞悬液，取200μL细胞悬液种入上室[2]。在37℃、50mL/L CO2的培养箱中孵育24h后，用棉签轻轻拭去滤膜上表面未穿透的细胞，利用MTS法检测穿膜细胞数，严格按照试剂盒说明书进行检测。移出小室，倒置风干，24孔板中加入500μL(1g/L)结晶紫，将小室置入结晶紫37℃孵育30min后取出，PBS冲洗3次，每次5min。各选择5个高倍镜(10×20)视野照相。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.4 胰腺癌细胞RNA的提取及RTPCR 经去甲肾上腺素干预后的MiaPaCa2细胞用RNAfast200试剂盒提取细胞中的总RNA。取RNA 5μL，用RT试剂盒合成cDNA链，再以逆转录反应液3μL作为模板，用25μL反应体系，加入PCR Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O 7.5μL，用PCR试剂盒进行扩增。MMP2引物序列为：上游5′CCGTCGCCCATCATCAAGTTC3′，下游5′GCAGCCATAGAAGGTGTTCAGG3′;MMP9引物序列为：上游5′TGGTCCTGGTGCTCCTGGTG3′，下游5′GCTGCCTGTCGGTGAGATTGG3′;VEGF引物序列为：上游5′CTGGGCTGTTCTCGCTTCG3′，下游5′CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC3′;内参照βactin引物序列为：上游5′ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG3′，下游5′AGGAAGGAAGGCTGGAAG
AGTG3′。PCR反应条件为：变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共35个循环，72℃延伸5min终止反应。扩增产物用2g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影。应用Chemi Image 5500自动电泳凝胶成像分析仪测定目标产物
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