止转染，荧光显微镜下观察，随后可用realtimePCR，Western blot检测目的基因的表达。
1.5 RealtimePCR实验 细胞总RNA的提取采用总RNA快速提取试剂(SUNBIOTECH公司)，具体方法参照试剂说明书。电泳鉴定RNA质量并在A260nm测其浓度。所有引物委托Invitrogen公司设计并合成，详见表1。使用逆转录试剂盒(MBI)进行逆转录。常规PCR优化扩增条件后，进行RealtimePCR实验。25μL的RealtimePCR体系中包括：12.5μL 2×SYBR Super Mixture，cDNA 1μL，上下游引物各100pmol，双蒸去离子水补足至总体系。RealtimePCR循环条件为：95℃预变性1min;95℃ 45s→退火45s→72℃ 45s，共进行45个循环;退火温度依据基因不同，分别优化设置。基因表达的相对定量方法为：以基因βactin mRNA的表达为内参，首先依据公式ΔC(t)=C(t)靶基因-C(t)βactin，分别计算实验组和对照组的ΔC(t);再依公式ΔΔC(t)=C(t)实验组-ΔC(t)对照组，计算出ΔΔC(t)值;最后计算相对表达量2-ΔΔC(t)。表1 引物设计序列及产物大小
1.6 Western blot实验 收集实验组和对照组细胞，PBS洗涤3次，RIPA裂解液在冰盒上裂解10min，提取蛋白，14000r/min离心，吸取上清液备用。BCA法测量总蛋白浓度，蛋白样品经SDSPAGE凝胶电泳约2h后，半干转膜1.5h，然后使用含相应一抗的封闭液(10%脱脂奶粉)4℃孵育过夜，用含辣根过氧化物酶标记的二抗的封闭液室温孵育1h，洗膜，ECL显色，照相并分析结果。
1.7 统计学处理 采用SPSS13.0软件，数据用±s表示，所有数据经检验均满足正态性分布，进行单因素ANOVA及TukeyKramer检验分析，以P<0.05为有显著性差异。
2 结 果
2.1 缺氧诱导后的RTPCR结果 缺氧诱导4、6、8h后HIF1α在mRNA水平上无显著变化(P>0.05)，随时间推移VEGF、CXCR4、COX2、5LOX均有不同程度的升高，与对照组相比具有统计学差异(P<0.05，图1)。
2.2 缺氧诱导后的Western blot结果 缺氧诱导4、6、8h后各基因蛋白表达与其mRNA水平变化趋势基本保持一致。虽然HIF1α在mRNA水平上无显著变化，但在蛋白水平有显著升高趋势(P<0.05)，并且结果显示：在常氧态下HIF1α蛋白也有微弱表达(图2、图3)。
2.3 siHIF1α的干扰效率的测定 运用Lipofectamine 2000将公司合成的4条siRNA序列、阳性及阴性对照siRNA转染入细胞，常规培养于37℃恒温，50mL/L CO2培养箱中12h后，直接转入30mL/L O2，50mL/L CO2，920mL/L N2的三气培养箱继续培养。缺氧诱导12h后，进行Western blot检测。结果显示：HIF1α蛋白表达与对照组相比均有下调，其中siRNA1干扰效率可达79%，siRNA4干扰效率可达76%，以下实验均以siRNA1序列进行实验(表2、图4、图5)。表2 siHIF1α序列设计
2.4 PDTC及siHIF1α干预后的RealtimePCR结果 实验分组：对照组(不加任何干预措施)、缺氧组(缺氧诱导12h)、PDTC组(50μmol/L)、PDTC+缺氧组(P+H)、siHIF1α组(siRNA)、siHIF1α+缺氧组(si+H)、PDTC+siHIF1α组(P+si)、PDTC+siHIF1α+Hypoxia组(P+si+H)。使用PDTC、siHIF1a及缺氧诱导12h三种因素单独或联合处理细胞(siRNA转染12h后，再继续缺氧诱导12h，操作同前)，通过RealtimePCR测定目标基因的变化。结果显示PDTC及siHIF1α均可以不同程度的下调与胰腺癌细胞增殖、侵袭相关基因的蛋白表达，并在一定程度上显示出对抗缺氧促胰腺癌进展的效应(图6)。
2.5 PDTC及siHIF1α干预后的Western blot结果 分组与处理方法与前述mRNA水平检测方法相同，通过Western blot测定目标基因的变化。除HIF1α表达丰度有更大波动外，各个基因蛋白表达与RTPCR变化趋势基本保持一致(图7、图8)。
3 讨 论
上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 外科论文 >> 正文