reatic carcinoma cells might make selfadjustment under hypoxia through the NFκB and HIF1α pathways to promote the expression of the downstreamrelated factors, which leads to the proliferation, invasion and metastasis. Besides, NFκB might be an upstream regulation factor to HIF1α.
KEY WORDS: pancreatic carcinoma; HIF1α; NFκB; hypoxia
胰腺癌具有早期诊断难、治疗难、发病隐匿、死亡率高的特点，发病机制至今仍不明确[1]。缺氧诱导因子1 (hypoxiainducible factor 1, HIF1)由调节性亚基α和结构性亚基β组成，是由低氧等诱导细胞产生的一种转录因子，是低氧信号转导过程中的关键因子，并和肿瘤增殖、侵袭密切相关[23]。在正常胰腺组织中，NFκB 在体内以p50/p65异源二聚体形式存在,此二聚体与其抑制因子IκB以非共价键结合，没有活性。而约67%的胰腺癌患者却呈现NFκB持续激活。NFκB的激活与瘤细胞的存活、血管的生成和侵袭性增加有关。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一类能促进血管生成的细胞因子，能诱导细胞的有丝分裂和调节内皮细胞的通透性[45]。VEGF及其受体介导的肿瘤血管新生在肿瘤的生长和转移中具有重要的作用[6]。趋化因子CXCL12(cxc chemokine ligand 12)及其受体CXCR4(cxc chemokine receptor 4)在胚胎发育、干细胞的迁移和各种免疫反应中发挥重要作用，是许多生理和病理过程中指导细胞运动的中心因素，动物实验表明CXCR4可能成为抑制肿瘤生长、转移的重要靶标[7]。5脂氧合酶蛋白(5lipoxygenase, 5LOX)是花生四烯酸代谢为白细胞三烯的关键酶，多种研究证实5LOX在恶性肿瘤的发生、发展过程中起了重要作用。抑制5LOX及其产物的表达有可能预防和逆转恶性肿瘤的发生。环氧合酶是催化花生四烯酸转化成前列腺素和其他二十烷酸类物质的关键酶[8]。大量研究表明，COX2在许多人类恶性肿瘤中表达显著上调，促进血管形成、增强肿瘤的侵袭性、增进免疫抑制从而减少凋亡等[9]。本研究旨在揭示缺氧状态下胰腺癌细胞是如何自身调节、在此过程中HIF1α与NFκB通路起到了怎样的作用，及对下游增殖、侵袭、转移相关因子的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 DMEM高糖型培养基购自GIBCO公司;新西兰新生牛血清购自ICP公司;胰蛋白酶及双抗购自Sigma公司;一抗购自Santa Cruz公司;二抗购自PIRCE公司;逆转录试剂盒购自MBI公司;荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司;PDTC购自Sigma;Lipofectamine 2000购自Invitrogen;siHIF1α RNA由上海吉玛公司合成。胰腺癌细胞株MiaPaCa2为本科室细胞库中传代冻存之细胞。
1.2 胰腺癌细胞株MiaPaCa2的孵育与传代 使用DMEM高糖培养基，以NaHCO3调整pH值在7.2～7.4，使用前添加80u/L青霉素和100u/L链霉素。新生牛血清56℃灭活30min，按照10%的比例加入DMEM高糖培养基。使用培养瓶常规培养于37℃恒温，50mL/L CO2培养箱中。每隔2～3d全量换液，每次2～3mL。当细胞覆盖率达到80%时，以2.5g/L胰蛋白酶、0.3mL/L EDTA溶液消化，通常按照1∶2～1∶3的比例传代。
1.3 缺氧诱导实验 将细胞放置于条件为30mL/L O2，50mL/L CO2，920mL/L N2的三气培养箱(NU4905型，NUAIRE，USA)培养，取0、4、6、8h的细胞进行实验。
1.4 siRNA转染 转染前1d，将胰腺癌细胞以每孔2×105的密度接种于6孔板中，用不含抗生素的DMEM高糖培养基培养。转染当天用无血清DMEM稀释siRNA，将之以4μL 100pmol/孔与Lipofectamine 2000按1∶2体积轻混，室温孵育20min以形成脂质体混合物，每孔600μL加入6孔板。轻轻敲击培养板30s使之混匀，放入培养箱孵育24h后更换培养液终
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