、rhIL4及rhTNFα等试剂均购自STRATHMANN BIOTECH GMBH，PE标记鼠抗人CD1a、CD80、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD56、CD83、CD86、HLADR单抗及鼠IgG1PE购自IMMUNOTECH,COULTER公司，RPMI 1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，MTT、二甲基亚砜购自SIGMA公司，IL2、IL1、CD3McAb、γIFN等试剂购自北京邦定生物制品有限公司。
1.2 标本来源
神经胶质瘤来源于青岛大学医学院附属医院神经外科2003年1～12月经病理诊断为胶质瘤的病人，共20例，男女各10例;年龄10～65岁，平均47岁;其中Ⅰ级4例，Ⅰ～Ⅱ级2例，Ⅱ级4例，Ⅲ级5 例，Ⅳ级5例。K562白血病细胞由中科院惠赠。
1.3 细胞制备
1.3.1 LAK细胞的制备 取病人外周静脉血，用肝素抗凝，淋巴细胞分离液水平离心机梯度离心(2 000 r/min,20 min)，吸取界面白膜层细胞，即为外周血单个核细胞(PBMC)，接种于24孔板，加入含体积分数0.10的FCS、106 U/L IL2的RPMI 1640培养液培养，每隔3 d换液，第6天收获细胞。
1.3.2 CIK细胞的制备 外周血PBMC接种于24孔板，加入γIFN 106 U/L，24 h后加入5×105 U/L IL1及IL2，100 μg/L CD3 McAb，隔天换液，补充IL2，剂量同前。第14天收获细胞。
1.3.3 DCs的诱导及CTLs的制备 分离外周血PBMC，加入24孔培养板，每孔1 mL,在37 ℃体积分数为0.05 CO2的饱和湿度培养箱内贴壁2 h，除去非贴壁细胞，用含rhGMCSF(106 U/L)、rhIL4(106 U/L)和体积分数为0.10 FCS的RPMI 1640培养液培养贴壁细胞，每3 d半量换液并补充新鲜细胞因子，第7天加入50 μg/L rhTNFα，第10天收获DCs。
将原代培养的胶质瘤细胞用培养液悬浮成浓度为5×109/L的细胞悬液，在-80 ℃冷冻2 min，37 ℃水中溶解4 min，反复4～5次，裂解物离心(8 000 r/min,20 min)收集上清，0.2 μm滤器过滤，肿瘤抗原与DCs以3∶1比例混合培养18 h，收集DCs,即为胶质瘤细胞抗原致敏的DCs。负载胶质瘤细胞抗原的DCs与淋巴细胞按1∶10混合培养3 d,即得针对神经胶质瘤细胞特异性CTLs。
1.4 免疫表型测定
收集培养细胞，用PBS洗涤1次，悬浮为2×109/L，每管100 μL加入离心管，加入单抗，4 ℃避光标记30 min,PBS洗2次，流式细胞仪检测。
1.5 体外杀伤实验
分别设立胶质瘤细胞实验组和K562细胞对照组，CTLs、CIK及LAK细胞为效应细胞，胶质瘤细胞和K562细胞为靶细胞，并分别设立效应细胞和靶细胞平行对照孔，培养液调靶细胞浓度为1×107/L，效应细胞浓度分4组：1×108/L、2×108/L、4×108/L、8×108/L，即效靶比为10∶1、20∶1、40∶1、80∶1，每种浓度设3个复孔，每孔效靶细胞各100 μL,总体积200 μL。细胞混匀，在37 ℃体积分数0.05 CO2的饱和湿度下培养48 h,实验终止前4 h每孔加入新鲜配制的5 g/L的MTT 20 μL，离心(1 500 r/min,5 min)去上清液，每孔加入分析纯DMSO 150 μL,振荡溶解5 min,于酶标仪上570 nm处读取A值，按下列公式计算杀伤率：杀伤率=[A1-(A3-A2)]/A1×100%。其中A1为靶细胞吸光度值，A2为效应细胞吸光度值，A3为效靶细胞杀伤反应后的吸光度值。
1.6 统计学处理
数据用±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 形态学观察
DCs从培养第2天起，细胞形态出现不规则改变，周边可见少量突起。第7天加入rhTNFα后，细胞体积增大，胞内颗粒增粗，颜色加深，从胞体周围伸出多个长短不一的树枝状突起。CIK细胞与LAK细胞诱导后细胞数量增多，体积明显增大，胞核密度加深，可见大量颗粒。
2.2 免疫表型测定
DCs高表达CD1a、CD80、CD83、CD86、HLADR;CIK细胞表面分子CD3、CD4、
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