续性感染能引起细胞多阶段恶性转化和上调癌基因的表达，并引起细胞生物学行为改变，提示支原体感染与肿瘤的发生有潜在的相关性[16]。目前，对于支原体感染与胃肠道肿瘤、卵巢肿瘤的关系已有较多报道，但关于其对肾癌的生物学致病作用鲜有报道。本研究通过巢式多聚酶链反应技术检测肾癌组织中的支原体DNA，探讨支原体感染与肾癌的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取本院1990年至2005年间肾癌石蜡包埋标本95例。其中男性69例，女性26例;年龄24-79岁，平均62.5岁。按肿瘤细胞类型分为透明细胞癌60例、乳头状肾细胞癌15例、嫌色细胞癌20例。肿瘤细胞的分化程度按Fuhrmans病理分级[7]，包括Ⅰ级51例、Ⅱ级31例、Ⅲ级13例;按TNM分期标准，分为Ⅰ期21例、Ⅱ期32例、Ⅲ期33例、Ⅳ期9例。随访3年以上者67例，5年以上者59例，随访时间2-13年。
1.2 实验方法
1.2.1 主要试剂
Buffer缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq酶(日本TaKaRa公司)，DNA Marker(北京天为时代科技有限公司)，琼脂糖为Spanish分装;酚氯仿抽提液(中国医学科学院生物医学工程研究所)，组织细胞裂解液、蛋白酶K(上海生工公司)。
1.2.2 支原体阳性对照菌株
支原体阳性对照菌株为支原体混合菌株，包括解脲脲原体、人型支原体、肺炎支原体、生殖支原体、发酵支原体、穿透支原体、梨支原体、关节炎支原体、猪鼻支原体、精氨酸支原体、口腔支原体和唾液支原体，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。
1.2.3 支原体通用引物的设计和合成
登录PubMed，检索GenBank核酸数据库中已登录各种支原体科微生物16srDNA基因和23srDNA基因序列，以及两种rDNA之间的间隔区核酸序列进行了比较，从中选择了两段高度重复的核酸序列，经PCRDESN分析合格后作为支原体通用引物[2, 8]，由美国HyClone & Pierce实验室合成。
外部引物：F1: 5′ACCATGGGAGCTGGTAAT3′，R1: 5′CTTCTCGACTTCCAGACCCAAGGCAT3′;内部引物：F2: 5′GTGCGGATGGATCACCTCCT3′，R2:5′GCATCCACCAAAAACCCTT3′。
1.2.4 巢式PCR检测
①肾癌标本中DNA的提取：从蜡块切取10μm切片5片，置入1.5mL Eppendorf管内，二甲苯脱蜡，95%-50%(体积分数)乙醇梯度水化，常规组织细胞裂解液、蛋白酶K消化，酚氯仿抽取DNA，Tris盐酸缓冲液(TE)溶解保存。②巢式PCR扩增：取模板5μL，每对引物各2μL(1mol/L)，dNTP 6μL(200mol/L)，10×Buffer缓冲液5μL，去离子三蒸水27μL，置FR800型基因扩增仪，93℃预变性2min后于80℃时加Taq DNA聚合酶1μL，此时总反应体积为50μL。热循环参数：预变性93℃ 2min，然后按93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35周期，最后72℃延长至2min[910]。外套通用扩增和内套特异扩增参数均相同。③琼脂糖凝胶电泳检测：电泳电压140V、30min，紫外检测仪观察结果，凝胶数字成像系统拍照。
1.3 结果判断
以支原体阳性对照菌株为阳性对照，以去离子三蒸水为阴性对照。观察巢式PCR凝胶电泳结果，扩增产物在280bp处出现特异性扩增条带，视为支原体DNA阳性[10]。如结果为阴性，则取备份标本，重复以上实验步骤，再次进行巢式PCR检测，两次均为阴性结果定为阴性，任一次出现特异性阳性条带定为阳性。
1.4 统计学处理
应用SPSS11.0软件包对实验数据进行χ2检验、Fishers确切概率检验及相关性分析，检验显著性水准为：α=0.05。
2 结果
2.1 肾癌组织中的支原体DNA的阳性率
在巢式PCR凝胶成像电泳图上支原体DNA阳性表达，为280bp处出现特异性扩增条带(图1)。95例肾癌组织标本中，支原体DNA阳性表达77例，阴性表达18例，阳性率为81.1%。
2.2 不同病理分级肾癌组织中支原体DNA的阳性率
Fuhrmans病理分级Ⅰ级(高分化)肾癌组织中的支原体DNA的阳性率为72.6%(37/51
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