近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建立及排斥反应观察

　　Key words： liver transplantation; inbred rat; acute rejection model

　　目前，肝移植术后急性排斥反应问题尚未得到圆满解决，而理想的动物模型是肝移植免疫研究的前提。因此，建立稳定的肝移植急性排斥模型显得十分必要。缺乏可靠遗传背景的移植免疫研究其价值为零，近交系大鼠因其遗传背景明确、单一，生物学特性资料详细等优点，已被广泛应用于大鼠器官移植急性排斥实验的研究[1]。

　　近年来，随着实验动物品种的引进，采用近交系大鼠进行移植免疫研究已成为可能。本研究对“二袖套法”进行了改良，选用LEW-BN组合建立大鼠原位肝移植模型(rat orthotopic liver transplantation, ROLT)，并观察其排斥反应的规律。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 清洁级雄性封闭群SD、Wistar大鼠，体重220～240 g(第三军医大学大坪医院动物所);清洁级雄性近交系LEW、BN大鼠，体重200～240 g(北京维通利华实验动物中心);标准条件下饲养。随机分为3组，G1(BN-BN)、G2(SD-Wistar)和G3(LEW-BN)，每组18对。

　　1.2 实验材料 采用5/7F心导管外鞘制成门静脉 (portal vein, PV)、肝下下腔静脉 (infrahepatic vena cava, IVC) 袖套;胆道支架采用22GA静脉留滞针外鞘;9-0无损伤缝线、双人双目手术显微镜、显微外科手术器械、全自动生化分析仪、光学显微镜等。

　　1.3 实验方法 在经典“二袖套法”基础上稍做改良，建立ROLT。

　　1.3.1 供体手术 麻醉成功后，腹部横切口进腹，背部垫自制背垫显露肝脏。全身肝素化后，在第一肝门后腹腔动脉上方分离腹主动脉，置线结扎。4℃ 乳酸林格液20 ml用输液泵经腹主动脉灌注，速度50～150 ml/ h，迅速在左肾静脉上缘剪开IVC，剪开膈肌离断胸腔段腔静脉，向供肝表面冲浇冰生理盐水。在灌注供肝的同时，按顺时针顺序游离肝周韧带，依次离断左膈静脉、食管入左肝血管支、右肾上腺、右肾及下腔静脉，紧贴膈肌环切断供肝肝上下腔静脉(suprahepatic vena cava, SVC)。于左右肝管汇合处远端0.5 cm 处楔形切开胆总管前壁，向近肝段插入胆道支架，丝线结扎固定。离断肝动脉，近PV切断幽门静脉及脾静脉。

　　1.3.2 供肝修整 操作均在4℃ 冰浴中进行。用微血管镊穿过自制袖套管腔，夹住IVC断端后拖出外翻于套管壁，刻槽内丝线结扎;同法处理PV套管，确保袖套管无扭曲。经PV袖套管缓慢注入4℃乳酸林格液5 ml后，将供肝置4℃乳酸林格液中保存。

　　1.3.3 受体手术 参照朱瑾等[2]建立的方法稍做改良。乙醚吸入麻醉诱导成功后，腹腔注射氯胺酮100 mg/kg。腹部正中切口入腹，自制拉钩将肋弓牵开，将剑突向头侧牵引;将肠管推向左下方，以温湿纱布包裹。按顺时针方向游离肝周韧带，结扎左膈静脉、食管入左肝血管支，在右肾静脉上缘平面游离IVC，切断右肾上腺上静脉，充分游离SVC。游离胆总管，在汇合处切断;游离切断肝固有动脉;在幽门静脉水平上方游离PV。依次靠近肝脏用血管夹阻断PV及IVC，从PV分叉处穿刺注入温生理盐水2～3 ml，用Satinsky 钳阻断SVC，紧贴肝切断SVC、IVC及PV，移去原肝。将供肝置入肝脏原位，用显微钳夹住PV套管柄，从PV推入温生理盐水2～3 ml驱出肝内保存液。用9-0尼龙线于供肝膈静脉处腔静脉壁外侧进针，锁边后按“内-外-外-内”的次序连续吻合后壁及前壁，收紧前用含肝素125 U/ml 的乳酸林格液驱尽腔内气泡，收紧后与预留线头打结。将阻断受体PV的血管夹下移至幽门静脉水平，排出PV内血液及血凝块，冲洗后迅速插入PV袖套，结扎后移去血管夹及Satinsky钳，供肝恢复血流，结束无肝期。将受体IVC血管夹下移至右肾静脉上缘，去除IVC内血凝块，冲洗后立即插入IVC袖套，丝线结扎固定。将胆道支架插入受体胆总管腔内，结扎后大网膜覆盖，腹腔注入含青霉素20万U的温生理盐水2 ml，关腹。术后予灯烤复温至苏醒，自由进10%葡萄糖水，术后第1天自由进食。

　　1.4 观察指标 观察受体术后一般表现、手术成功率(术后生存超过48 h) 和生存时间。每组术后第3、7、14、21天随机活杀3只大鼠，取血离心，收集上清液，检测肝功能;取肝组织

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