脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl

　　1.5 海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量的测定

　　1.5.1 总RNA提取 采用异硫氰酸胍法提取总RNA。获取的总RNA用分光光度计测量纯度及浓度后置-80℃保存备用。

　　1.5.2 反转录合成cDNA 在50μL的反应体积中加入5μg总RNA，10μL 反应缓冲液，5μL 10mol/L dNTPs，0.5μL Rnasin(40u/μL)，0.25μg oligo(DT)12-18，4μL 反转录酶(200u/μL)，0.5μL 0.1mol/L DTT，置37℃孵育1h，然后于65℃加热5min，储存于-30℃。

　　引物设计及合成按照已报道[2]的Bcl2 cDNA设计其相应的特异性引物(引物序列5′CACCCCTGGCACTTCTCCTTC3′;5′CACAATCCTCCCCCAGTTCACC3，扩增产物长度303bp)。大连宝生物公司合成。

　　1.5.3 PCR扩增 在25μL的反应体积中加入合成的cDNA 0.1μg，2.5μL 10×PCR缓冲液，2.5μL 2mol/L dNTPs，2.5μL 25mol/L MgCl2，1μL各引物(pmol/μL)，0.5μL Taq DNA聚合酶(5u/μL)。使用PTC100 PCR仪进行热循环。循环条件：93℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，进行一个循环;93℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，进行32个循环;72℃ 延伸8min。取扩增产物10μL，经30g/L琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统进行检测，用Labworks软件对各阳性条带的密度进行分析，计算各阳性条带的平均密度值与βactin条带平均密度值之比。

　　1.6 Bcl2蛋白表达的观察 将获取的切片脱蜡至水，置入枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)行微波抗原修复10min;冲洗后滴加3%(体积分数)H2O2 阻断内源性酶15min，冲洗5min;滴加Bcl2抗体(Stanta Cruz，1∶1000)50μL，4℃孵育过夜，PBS冲洗，参照SABC试剂盒说明(博士德公司)分别滴加二抗及StreptavidinPeroxidase，DABH2O2混合液显色，封片，镜下观察。

　　1.7 Westernblot

　　1.7.1 蛋白提取及浓度测定 将收取的脑组织置提取缓冲液中制成匀浆，4℃，15000r/min离心20min，收集上清，移入另一管中(浆蛋白)于溶解缓冲液中溶解沉淀，室温静置30min ，取上清移入另一管中(膜蛋白)，置于-70℃保存。用Bradford法测定蛋白含量。

　　1.7.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 将蛋白样品与样品缓冲液混合(4∶1)，每孔蛋白为50μg，总体积20μL;将样品加热至100℃×3min，旋转3s;将样品溶液加入加样孔，20mA恒流下电泳。

　　1.7.3 Westernblotting 电泳后，将凝胶中的蛋白转至硝酸纤维素膜(NC)上，20g/L脱脂乳/TBS处理NC膜，室温下将NC膜置入含有Bcl2一抗(1∶1000，含5g/L脱脂乳/TBS)孵育1-4h，TBST缓冲液洗10min×3次， 室温下，将NC膜分别置入含有二抗的稀释液中(酶标羊抗兔IgG， 1∶5000，含5g/L脱脂乳/TBS)孵育1h，TBST缓冲液洗10min×3次。将膜浸入AP缓冲液，显色(10×AP缓冲液1mL，0.1mol/L MgCl2 0.5mL，D.W. 8.5mL，BCIP 30μL，NBT 40μL)10min，观察各阳性条带，用Labworks软件对阳性条带的密度进行分析，计算各阳性条带的平均密度值。

　　1.8 统计学处理 采用SPSS统计软件行统计学处理，数据用±s表示，行组间方差分析。

　　2 结果

　　2.1 全脑缺血后血糖的变化 全脑缺血前后各组鼠血糖浓度无明显差异。缺血组与治疗组比较血糖浓度则无显著差异(表1)。

　　表1 各实验组血糖浓度变化(略)

　　Table 1 The changes of blood glucose in different group

　　*P>0.05 vs. ischemic group

　　2.2 全脑缺血后海马CA1区Bcl2 mRNA相对含量的变化 在缺血组及胰岛素治疗组海马CA1区，于各取材时间点均可见Bcl2 mRN

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