人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达

　　酵母细胞用裂解缓冲液悬浮 (50 mM 磷酸钠, pH 7.4; 5% 甘油; 1 mM PMSF)。等体积酸洗玻璃珠加入裂解液中后，混合物在漩涡混匀器上震荡30 s, 紧接着冰上孵育30 s。4 min内将上述步骤重复4 次。总裂解液与MagneHis 镍基颗粒混匀5～10 min。经过MagneHis洗涤缓冲液两次清洗后，用MagneHis洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱。总裂解液、流出液组分及部分纯化组分分别用免疫印迹法(western blot)检测裂解与纯化效果。

　　2 结 果

　　本研究中，HBV-Pol基因由从2307 to 1623 的HBV DNA所编码，具有843个氨基酸残基。表达产物用免疫印迹法(dot blotting 和western blotting)检测。

　　2.1 酵母系统的诱导表达与优化

　　相对于其它微生物，Saccharomyces cerevisiae早已为人熟知的遗传学特性使得它成为最常用于重组蛋白表达的真核细胞表达系统之一。本试验中，重组HBV-Pol的表达遵循了两个策略：一是采用羧基端的6聚组氨酸标记，便于目的蛋白的快速纯化。二是将V5抗原(Gly- Lys- Pro- Ile- Pro- Asn- Pro- Leu -Leu -Gly -Leu -Asp -Ser -Thr)融入羧基端的重组蛋白中，便于采用V5 特异性抗体来检测表达效率。

　　本试验采用了斑点杂交(dot bloting)来确定HBV-Pol表达条件优化。同时也尝试了一些公认较好Saccharomyces cerevisiae诱导优化策略并进行一些改进。首先，用较长的培养时间来代替较短的过夜培养来获得较高的细胞密度;其次，预试结果表明相同容器内(250 mL 锥形烧瓶)较小体积(不大于25 mL)的培养效果要优于同条件下正常体积培养液(50 mL)中的培养;最后，采用较大的容器(500 mL)，其更大的液体表面可以使摇动培养中的细胞获得更多的氧。根据斑点杂交(dot bloting) 的结果, 非转化株的总裂解液中并无目的蛋白存在(图中1)，未诱导转化株的总裂解液中则有一较低的目的蛋白水平存在(图2中2)，提示该营养缺陷型转化株在缺乏脲嘧啶的选择性培养基中生长良好。经过16 h的诱导后，在总裂解液中存在着很高水平的目的蛋白(图2中3)。

　　1 μL的总裂解液点在硝酸纤维素膜上，封闭后用V5抗体识别，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS照相机进行化学荧光检测。1.阴性对照-未转化株总裂解液;2.未诱导转化株总裂解液;3.诱导16 h后的转化株总裂解液

　　2.2 HBV-Pol的纯化

　　由于聚组氨酸标记的蛋白和镍基基质纯化系统快速简便的特点，已被广泛应用于重组蛋白的纯化。本试验中，镍基颗粒替代了传统的柱亲和层析系统来进行目的蛋白的纯化。 根据免疫印迹(western blotting)的结果, 约100 kD的目的蛋白条带分别存在于诱导后转化株的总裂解液(TL)与纯化组分(PF)中。纯化组分中的目的蛋白信号远强于其它各组，在流出液组分(FT)中则没有目的蛋白存在。该结果提示重组的HBV-Pol 能够在酵母表达系统中表达，并很可能在没有协同表达的分子伴侣存在的情况下保持稳定;采用镍基颗粒系统进行纯化效率较高。

　　10 mg的诱导16 h的醇母转化株的总裂解液(TL)，流出液(FT)和纯化后组分(PF)分别用4%～12%的SDS-PAGE进行分离并转移到PVDF膜上，封闭后用V5抗体识别后采用Bio-Rad ChemiDoc XRS照相机进行化学荧光检测。50kD的marker条带处与2抗有交叉活性

　　3 讨 论

　　长期以来关于人HBV-Pol的研究一直存在很多困难，诸如该蛋白难于在异源性系统中表达及在天然状态下纯化等。尽管重组的人HBV-Pol 已经通过很多方式在不同系统里尝试过表达和纯化，纯化出的有活性并可用于生化研究的HBV-Pol仍是难题。

　　人HBV-Pol是一种多功能的蛋白质，在异源性表达系统和在纯化过程中极不稳定[9]。但在本研究中，尽管没有协同表达分子伴侣，仍然有一小部分完整的HBV-Pol 存在于诱导后转化株的总裂解液中。这部分目的蛋白可以通过镍基亲和层析的方法进行纯化。免疫印迹的结果比较提示这种镍基颗粒可能适用于大规模的人HBV-Pol纯化。

　　本研究结果也证明较短的纯化时间是获得完整人HBV-Pol的另一个重要因素。根据之前试验的结果，镍基质柱层析纯化很难得到免疫印迹法可以探测水平

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