人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达

　　尽管HBV-Pol在其生命周期中起到至关重要的作用，但是由于HBV-Pol在异源性表达系统中的表达水平低[8]、可溶状态下极不稳定[9]，协同表达的分子伴侣对该酶的潜在影响[10]等原因，关于该酶的生化研究仍然进展缓慢。Kim 等人在协同表达的GRP94的情况下，在大肠杆菌内表达出麦芽糖结合蛋白标记的HBV-Pol，并证明其对乙肝病毒的εRNA有优先结合的特征[11]。Qadri 和Siddiqui[6]在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.C.)表达系统中利用基于Ty1-his3AI 逆转座子构建的质粒表达并得到了部分纯化的HBV-Pol，该HBV-Pol在一种病毒类似颗粒中可以将Ty1 RNA逆转录为DNA。然而稳定的、不需要分子伴侣协同的大规模地在常用异源性表达系统(如大肠杆菌或酵母)中得到完整的HBV-Pol的方法目前仍未见报道。

　　酵母表达系统在重组蛋白表达研究中得到非常广泛的应用，其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.c.)又是最常用的酵母菌株，本研究中，6聚体组氨酸标记的全长HBV-Pol在S.c.中进行表达并用镍基颗粒进行部分纯化。免疫印迹的结果提示在酵母体内表达人HBV-Pol是一种可靠地进行大规模HBV-Pol制备方法，该方法可能会对该蛋白的生化特性研究和纯化，以及特异性抗体的研究提供便利条件。

　　1 材料与方法

　　1.1 酶与试剂

　　pYes2.1topo-His 质粒和V5抗体购买自Invitrogen (US); MagneHis蛋白纯化试剂盒购自 Promega (US); PrimeSTARTM 高保真DNA聚合酶购自TAKARA株式会社 (Japan); T4连接酶及限制性内切酶购自New England Biolabs. DNA质粒纯化试剂盒购自Qiagen (Chatsworth, CA). Saccharomyces cerevisiae(S.c.)菌株(基因型： MATαSUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1)购自ATCC公司。 其它药品均购自Sigma公司。

　　1.2 质粒构建

　　从已经发展成肝细胞癌的慢性乙肝患者部分肝脏切除术后得到少许肝脏组织，切成小块后迅速放入液氮保存。十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)蛋白酶K 消化后采用酚-氯仿提取法得细胞DNA[12]。 HBV-Pol DNA 序列[从第2 307到1623碱基对，共843个氨基酸残基] (GenBank序列号 AF286594) 由PrimeSTARTM 高保真酶进行扩增，引物序列为CPNotIF01: GTT GCG GCC GCA TAA TGG CCC TAT CTT ATC and CPBstBIR01: ATT TTC GAA TTC TCA CGG TGG TTT CCA. pYES2.1topo-His-P 构建方法见图1。于杨，等：人乙型肝炎病毒聚合酶在酿酒酵母中的表达辽宁医学院学报 2008年10月，29(5) 图1 pYES2.1topo-His-P结构如图所示。全长HBV-Pol序列在酶切位点NotI和 BstBI间连入，pYES2.1TOPO-His-P。V5 抗原和多聚赖氨酸尾位于HBV-Pol 3 —末端。质粒表达受控于 Gal 启动子，预计融合蛋白约为96 kD

　　1.3 酵母转化株筛选

　　参照试剂盒说明书将纯化的pYES2.1topo-His-P 质粒转化入感受态酵母。转化株用SC-U (缺少脲嘧啶的最低培养基) 选择性平板培养基 {0.67% 酵母氮基, 2% 碳基, 0.01% (腺嘌呤, 精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸, 色氨酸), 0.005% (天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸) 2%琼脂}进行筛选。

　　1.4 转化株诱导

　　从SC-U平板培养基上挑取一个转化株菌落并接种在含有2%的棉子糖或2%葡萄糖15 mL选择性培养液中(与SC-U plate 成分基本相同，仅缺少脲嘧啶和琼脂)。 30°C于摇床内培养3 d后测定培养液的OD600数值。更换为诱导培养液(与选择性培养液成份基本相同,碳源为2%的半乳糖和2%棉子糖)。将得到的酵母细胞用诱导培养液重悬至OD600=0.4，同样条件下继续培养14～16 h后,1 500 g离心收获细胞待用。斑点杂交(dot bloting)检测诱导效果。

　　1.5 细胞裂解与蛋白纯化

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