1 4 GalT I在大鼠坐骨神经损伤后脊髓和背根神经节中的表达

　　[Key words] Sciatic nerve injury;β1，4-GalT I;Real-time polymerase chain reactin; In situ hybridization;Spinal cord;Dorsal root ganglion;Rat

　　机体中具有重要生理和病理作用的糖复合物是指含糖链的生物大分子，包括糖蛋白、糖脂、蛋白多糖和杂多糖等。糖基转移酶主要存在于内质网和高尔基体中，将翻译的蛋白质加工成成熟的糖蛋白。半乳糖基转移酶属于糖基转移酶这一大家族中的一个亚类，它们都以UDP-半乳糖苷为糖基供体。β-1，4-GalT I是最早被克隆的一种糖基转移酶，为单链跨膜Ⅱ型膜糖蛋白[1]。除在高尔基体合成糖苷键的功能外，还表达在细胞膜上，通过结合毗邻细胞质膜上或细胞间质中的糖复合物末端的N-乙酰氨基葡萄糖或半乳糖基而发挥细胞黏附作用[2]。已有研究发现，β-1，4-GalT I在损伤后坐骨神经中发生表达变化，主要表达于施万细胞中[3-4]，但对坐骨神经损伤后相应节段脊髓及背根神经节中β1，4-GalT I的研究尚未见有报道。本课题主要观察β1，4-GalT I mRNA坐骨神经损伤后相应节段脊髓和背根神经节中的表达变化，进一步探讨β1，4-GalT I在坐骨神经损伤过程中的作用。

　　1　材料和方法

　　1.1 实验动物 成年体质量200～220 g 的SD 大鼠，雌雄不拘， 由复旦大学实验动物中心提供。

　　1.2 模型制备 SD 成年大鼠共48 只，随机分为8 组，即正常对照组及坐骨神经损伤后6 h 、12 h 、1 d、2 d、1 w、2 w、4 w，每组6 只。根据文献[5]的方法，对损伤组大鼠行单侧坐骨神经夹伤术或坐骨神经横断术。主要过程为： 将SD大鼠随机分8组，每组12只，复合麻醉剂(xylazine， 10 mg/kg; ketamine， 95 mg/kg; acepromazine， 0.7 mg/kg)腹腔注射麻醉。每只大鼠均以左侧坐骨神经为正常对照侧，右侧坐骨神经为手术侧。手术时，暴露大鼠双侧坐骨神经，左侧进行假手术，右侧在距梨状肌下孔0.5 cm处切断坐骨神经，远侧端截除0.5 cm神经端。实验大鼠手术后分别存活6 h、12 h、1 d、2 d、1 w、2 w、4 w，在麻醉下分别取大鼠坐骨神经相应节段脊髓和背根神经节进行实验。

　　1.3　　　总RNA的提取 将不同实验分组大鼠腹腔麻醉，严格无菌操作，各实验组均取坐骨神经相应节段脊髓组织和背根神经节。采用Invitrogen 公司的Trizol 试剂盒， 按说明书操作， 提取脊髓和背根神经节组织中的总RNA，溶解于1 ml Trizol 中，-80 ℃保存。以电泳和波长260 nm 光谱吸收的情况来判断所抽提RNA的质量和浓度。

　　1.4　　　cDNA合成 采用Fermentas 公司的逆转录试剂盒， 按说明书操作， 合成cDNA。

　　1.5　　　Real time-PCR 以上述cDNA 为摸板进行实时荧光定量PCR 检测。以β2-M基因的表达作为内参。β1，4-GalT I和β2-M引物和探针序列详见表1。

　　数据处理方法：以同一份标本β1，4-GalT I拷贝数/β2-M 拷贝数表示β1，4-GalT I 基因的表达水平， 并以此值作图。3 次独立实验， 每次实验重复3 次。

　　1.6　　　取材与切片 用复合麻醉剂(5 ml/kg) 腹腔麻醉经心灌注固定。取坐骨神经相应节段脊髓和背根神经节浸于 4%多聚甲醛中，外固定时间不超过6 h，20%蔗糖、30%蔗糖依次梯度脱水。OCT包埋，连续切片，切片厚度10 μm。

　　1.7　　　原位杂交 组织切片43 ℃烤片过夜，DEPC 水洗，0.2 mol/L HCl、0.3%Triton X-100、0.2%甘氨酸/PBS 作用， 蛋白酶K(1 μg/m1) 37 ℃消化25 min。0.2%甘氨酸/PBS、PBS 孵育。4%多聚甲醛室温固定;PBS、乙酸酐/ 三乙醇胺孵育。酒精梯度脱水，空气干燥。42 ℃预杂交2 h。42 ℃于湿盒中杂交10~18 h( 杂交时探针序列同Real time-PCR) 。杂交后经依次经( 2×SSC、l×SSC、0.1×SSC) /0.1% SDS 43 ℃洗涤;Buffer Ⅰ 室温孵育10 min，Buffer Ⅱ 37 ℃孵育30 min。加入抗地高辛抗体4 ℃过夜。显微镜观察结果并拍片。实验在相同的条件下重复3 次，每次

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