rease in apoptosis rate of hippocampus cells (P<0.05 or P<0.01); increased expression of Bcl-2 in HBOT group (P<0.05) and significantly decreased expression of Bax (P<0.01). Conclusion The early HBOT can promote Bcl-2 expression and inhibit Bax expression, which is effective in inhibiting apoptosis rate following craniocerebral injury.
Key words: brain injury; early stage; hyperbaric oxygenation; Bcl-2; Bax; apoptosis
1955年美国学者Rink等[1]首先证实颅脑损伤后神经细胞存在着凋亡现象以来，许多学者研究表明：在颅脑损伤早期，脑损伤的机械性创伤破坏脑组织造成局部出血和缺血，通过各种诱因调控诱导半暗带区脑细胞的凋亡。Conti等[2]的大鼠脑损伤实验结果显示：急性期和延迟性神经细胞死亡均与细胞凋亡有关，脑损伤后12 h即出现细胞凋亡。本研究通过制作大鼠自由落体脑损伤模型，予以早期高压氧处理，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,运用免疫组化方法对颅脑损伤后应激期指标及凋亡相关基因Bcl-2、Bax进行定性、定量研究，探讨高压氧在颅脑损伤早期保护神经细胞的分子机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及处理 雄性SD大鼠100只，体重(300±20)g，由徐州医学院实验动物中心提供，随机分成正常组(Nor组)20只、创伤组(TBI组)40只、高压氧治疗组(HBOT组)40只。Nor组：不作任何处理。HBOT组：致中等程度脑损伤，颅脑损伤后6 h内行第1次高压氧治疗，以后每天1次。 TBI组：处理步骤同HBOT组，不同之处是高压氧舱加压后木箱内不充氧气，而是给予压缩空气。HBOT组分别于致伤后8 h及1、3、5、8天进行高压氧治疗后，Nor组、TBI组于相对应时间点，处死大鼠取标本进行苏木精-伊红染色观察,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达。
1.2 大鼠颅脑损伤模型制作 动物称重麻醉后，头顶部备皮，碘伏局部消毒。沿右侧顶部切开头皮约1.5 cm，钻开骨窗，直径约5 mm，保持硬脑膜完整。采用Allen′s改良法[3]致伤造成右颞顶叶的脑挫裂伤，用骨蜡封闭骨窗，缝合切口。动物无死亡，左侧轻度偏瘫。
1.3 高压氧治疗 HBOT 组大鼠致伤6 h内，使用Y-C14+4型改良动物实验舱进行高压氧治疗。治疗过程为：将动物置于80 cm×45 cm×40 cm的特制木箱(连接给氧装置)内，木箱置于国产双舱四门式加压舱内，随即用压缩空气加压，升压时间20 min,升压10 min时开始向木箱内充氧气(纯氧供给，高压氧操作系统控制充氧过程)，压力升至200 kPa后稳压，在该压力下继续持续充氧30 min，停止充氧10 min，之后再次向木箱内充氧30 min，然后等速减压20 min，出舱。开始升压时，大鼠活跃，随即安静，给氧约40 min后大鼠又表现活跃和兴奋，无抽搐和死亡。舱内温度18～24℃。
1.4 组织病理学检查 于规定的不同时间点，在深麻醉下开胸，暴露心脏，先快速(约10 min)灌注生理盐水约150 ml，冲净血液，再以4℃10%多聚甲醛液350 ml灌注，完毕即开颅取脑，立即置于4℃10%多聚甲醛液中后固定6 h, 以脑挫伤组织为中心做冠状3.5 mm厚切片，常规脱水、石蜡包埋，片厚5 μm连续冠状切片3～4套，贴于备好的载玻片上，放于烘干机上烤12 h，分别进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色，镜下观察皮质及CA1、CA3区细胞和灰度值。
1.5 流式细胞仪检测细胞调亡率 于规定的不同时间点麻醉后快速断头，于冰上取脑挫伤皮质组织，研磨均匀，制备单细胞悬液。取制备好的单细胞悬液0.5 ml，加入乙醇至终浓度为70%，于4℃固定45 min，1 000 r/min离心10 min，去上清，加入1 g/L的RNAse 0.2 ml，37℃孵育30 min， 4℃避光保存30 min后上机检测。在DNA组方图上，G1峰前出现一个亚G0峰，分析该峰所占的百分比即可得出凋亡细胞的百分比。
1.6 统计学处理 所有数
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