743±0.092, respectively. There were significant differences between these groups (P<0.01). The expression of PTTG protein decreased in X-ray treatment groups, which was also positively correlated with the increase of X-ray doses. The integrated optical density (IOD) of PTTG protein in groups A, B, C and D were 1.840±0.089, 1.395±0.139, 0.893±0.125, 0.597±0.104, respectively. There were significant differences between these groups (P<0.01). Conclusion Ionizing radiation can decrease the expression of PTTG mRNA and the protein in glioma C6 cells in a dose-response relationship.
Key words: glioma; ionizing radiation; pituitary tumor transforming gene
很多实验已经证实X射线可以影响众多参与肿瘤发生、发展的基因的表达，通过基因改变对肿瘤细胞周期的调控而调节肿瘤细胞的增殖和凋亡。垂体瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene， PTTG)是一种促进肿瘤细胞生长的基因，而电离辐射对该基因有何影响，国内外均鲜见报道。本研究应用不同剂量的X射线作用于胶质瘤C6细胞，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PTTG mRNA的表达,免疫细胞化学检测其蛋白表达,探讨电离辐射对胶质瘤C6细胞垂体瘤转化基因表达的影响，为探讨放疗对肿瘤细胞增殖和凋亡的调节机制提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 胶质瘤C6细胞(中国科学院上海分院)，DNTP、Taq DNA聚合酶(dT)、Oligo15、 AVM逆转录酶(Promega公司)，鼠抗人PTTG单克隆抗体 (Santa Cruz公司)，链亲合素卵白素-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase, SP) 、DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。
1.2 细胞培养、X射线处理及分组 胶质瘤C6细胞在含有 10%新生小牛血清、青霉素1×105 U/L、链霉素1×105 U/L DMEM培养基中，5% CO2、37℃条件下培养。分为A、B、C、D 4组(n=6)。A组(空白对照组)不进行X射线照射处理;对数生长期的细胞采用医用直线加速器的6 MV X射线照射，按照射剂量分为2 Gy (B组)、4 Gy(C组)、6 Gy(D组) 3个剂量组，照射野为10 cm×10 cm,等中心照射，照射完毕常规培养12 h后进行检测。
1.3 RT-PCR 检测PTTG mRNA的表达 Trizol提取总RNA，分光光度计测定RNA的浓度和纯度。RT-PCR 检测PTTG mRNA的表达，以β2-微球蛋白(β2-M)为内参照，设计PTTG、β2-M引物序列如下(上海生物工程公司合成)：PTTG引物上游5′-CTAAGGATGGGCTGAAGCTG-3′,下游5′-CAAACAGGTGGCAATTC-3′，扩增长度496 bp;β2-M引物上游5′-GTAAGCAGCATCATGCA-3′，下游5′-TGGAGGAACCTGGTCA-3′，扩增长度300 bp。合成cDNA的第一链反应体系为25 μl，包括Oligo15 0.5 μg, AVM逆转录酶10 U。以cDNA为模板的PCR反应体系包括：逆转录混合液4 μl，Taq DNA聚合酶0.8 μl，两种引物(50 μmol/L)各1 μl。PCR循环条件：变性95℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，延伸72℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶在图像分析系统分析，计算PTTG的光密度值，以β2-M的光密度值为参照,计算比值。
1.4 免疫细胞化学检测PTTG蛋白表达 制备细胞片，采用SP法检测PTTG蛋白表达，以肿瘤细胞中出现黄色或棕黄色着色或颗粒为PTTG蛋白阳性表达
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