白检测。
1.2 试剂与方法
Skp2鼠抗人单克隆抗体(克隆号1G12E9),P27鼠抗人单克隆抗体(克隆号DCS—72.F6)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。标本采用链霉卵白素—过氧化物(SP)法，具体操作按说明书进行，切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，3%过氧化氢处理10min，抑制内源性过氧化物酶活性。正常羊血清处理15min减少非特异性背景。Skp2和P27单克隆抗体(抗体稀释比1∶50)，一抗4℃孵育过夜，二抗处理15min链霉菌抗生素蛋白——过氧化物酶复合物处理15min，DAB显色来自水冲洗终止反应，苏木精复染、脱水、透明、封化。用磷酸盐缓释液替代一抗作为阴性对照，用已知乳腺癌作为阴性对照。
1.3 结果判定
Skp2、P27以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞[2]，在400倍光镜下观察10个视野，计数1000个肿瘤细胞计算阳性细胞百分率。
1.4 统计分析
采用 SAS统计分析软件，进行单因素方差分析临床病理资料与免疫组化结果以及Skp2和P27之间相关性，检验水准α为0.05，P<0.05为统计学差异有显著性。
2 结果
2.1 Skp2在正常膀胱粘膜与膀胱移行细胞癌组织中的表达情况
在正常22例粘膜中Skp2阳性表达率13.6%(3/33)。在73例膀胱移行细胞癌组织中，Skp2蛋白阳性表达率50.7%(37/73)，显著高于正常粘膜(P<0.05)。
2.2 Skp2蛋白表达与膀胱移行细胞癌临床病理的特殊关系
Skp2蛋白表达与膀胱移行细胞癌肿瘤组织分级显著相关(χ2=11.55, P<0.05), 与临床分期显著相关(χ2=10.5,P<0.05), 有淋巴转移组Skp2蛋白水平显著高于无淋巴转移组(P<0.05)。
3 讨论
P27是调节细胞周期的周期素激酶抑制因子，P27mRNA在正常细胞周期中是恒定的，蛋白水平在G0，G1期最高，在S、M期较低。P27对细胞周期G1—S节点有重要的调控作用，抑制细胞的增殖。当肿瘤细胞受到癌性生长信号刺激时，P27水平降低促进G1期的进展，增加细胞增殖的速度，促进肿瘤的发生发展。低表达的P27已在多种肿瘤中观察到，如：淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、肝癌等。在非小细胞肺癌、口腔磷状细胞癌、大肠癌和前列腺癌以及乳腺癌的研究中证实，P27水平越低预示着肿瘤预后越差[3～7]。
Skp2基因染色体5p113，是Fbox蛋白家族中成员之一，在泛素蛋白酶体途径中能特异性识别底物，并与之结合使之进入泛素化降解。Skp2通过对多种靶蛋白的泛素化降解与细胞周期调控及肿瘤发生发展和预后密切相关。目前研究发现P27蛋白水解主要是通过泛素化-蛋白水解体途径完成[8]，P27的水平取决于Skp2依赖的蛋白水解，细胞由静止状态进入增殖状态需要P27的降解。Skp2是正常或异常细胞进入S期必须的， Skp2首先在G1—S期之间出现，在S—G2期升高，在M期快速下降。吕增会等[9]用免疫组化方法，在对69例胃癌组织28例正常胃粘膜组织检测Skp2的表达水平时发现正常粘膜组织中Skp2表达水平极低，而在胃癌组织中表达水平明显增加。两者有显著差异(P<0.05)， 且Skp2高表达患者预后较差。Yang等[10]发现Skp2在正常的前列腺腺上皮和基底细胞中较低，而在癌前病变和前列腺癌标本中显著增高，且Skp2的表达与临床分期、转移正相关。郑祥毅等[11]应用同样方法检测41例前列腺癌和20例良性前列腺增生组织Skp2表达情况亦有同样发现。本研究发现Skp2在正常膀胱粘膜中呈低表达，在膀胱移行细胞癌组织中呈高表达，与肿瘤分级、临床分期呈正相关，差异有显著性。浸润型、有淋巴转移组中Skp2表达明显高于表浅型和无淋巴转移组(P<0.05)。提示Skp2与膀胱癌的发生有关，检测其蛋白表达水平对判断肿瘤恶性程度、转移情况、估计预后有一定意义。
本研究结果发现在BTCC中P27表达随Skp2的上升而降低，两者呈负相关。两者在细胞周期进展中的平衡失调，导致膀胱移行细胞癌发生发展。联合检测其蛋白表达水平对判断肿瘤恶性程度、转移情况、估计预后具有重要意义。靶向Skp2的抗癌治疗预防膀胱癌复发具有广泛前景。表1 Skp2在BTCC和正常膀胱粘膜组织中的表达表2 Skp2在Ⅰ、Ⅱ、ⅢBTCC中的表达
【参考文献】
1 Carrano AC,Eytan E,Hersh
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