Survivin基因与NET 1蛋白在膀胱癌中的表达及相互关系

　　【关键词】 膀胱癌;survivin基因;NET-1蛋白;逆转录聚合酶链反应;免疫组化

　　Survivin是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，主要通过抑制 caspase-3 和caspase-7的活性而抑制细胞凋亡过程，NET-1是新发现的细胞增殖因子，参与了肿瘤细胞的增殖。我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化方法分别检测2000年1月~2005年1月间我院收治膀胱癌患者27例癌组织中survivin mRNA和 NET-1蛋白表达情况，探讨两者的关系以及与膀胱癌临床病理关系，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织来源 膀胱癌27例术前均未经放疗和化疗，新鲜组织(距癌边缘2cm)离体后分2份，1份石蜡包埋，1份由液氮转运置于-70℃冰箱内保存备用。所有标本病史资料完整，均经临床、病理确诊，其中男19例，女8例，年龄31~87岁，平均59岁，均为初次手术。按WHO病理分级Ⅰ级8例，Ⅱ级12例，Ⅲ级7例;按TNM分期T1 6例，T2 10例，T3 5例，T4 6例，病理诊断为膀胱移行上皮细胞癌，且均获门诊随访，时间为6个月~5年。对照组10例膀胱正常组织由南通大学法医教研室提供，均经病理证实。

　　1.1.2 试剂和仪器 Trizol为美国Invitrogen公司产品;RT-PCR试剂盒为荷兰QIAGEN公司产品;DNA Marker DL 2000购自日本TaKaRa公司;Taq DNA聚合酶与PCR 10×Buffer购自上海生工生物技术工程有限公司;PCR仪为美国MJ Research公司产品;凝胶图像分析系统为上海四新生物技术有限公司产品;核酸和蛋白质含量测定仪为德国Eppendorf公司产品。

　　1.1.3 引物合成 Survivin的上游引物序列为：5′-CAAGGACCACCGCATCTC-3′，下游引物为：5′-TTCTCCGCAGTTTCCTCAA-3′，扩增目的基因产物长度为348bp。采用GAPDH为内参照。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织总RNA的提取 100mg膀胱癌组织置于玻璃匀浆器中，加入Trizol试剂1ml匀浆后置室温5min，加入氯仿0.2ml，于4℃ 12000g/min离心15min，取上清，加异丙醇0.5ml 15min后于4℃、12000g离心15min，取沉淀溶于无RNA酶的去离子水中用于RT-PCR扩增， 抽提出的RNA经凝胶电泳鉴定RNA质量，OD260/280鉴定RNA的纯度。

　　1.2.2 cDNA合成 在无RNA酶的离心管中加入RNA 2μl (含总RNA 2μg)，依次加入10×Buffer 2.0μl; 5mmol/L dNTPmix 2.0μl;Oligo-dT引物1.0μl;Omniscript Reverse Transcriptase 1.0μl;RNase-free水10.0μl; 总体积20μl 置于37℃孵育60min。然后加入20μl DEPC水终止反应，-20℃保存备用。

　　1.2.3 聚合酶链式反应 在0.5ml PCR管中，依次加入下列试剂：cDNA 2μl，survivin上下游引物(10μmol/L)各1μl，GAPDH上下游引物(10μmol/L)1μl，dNTPmix(2mmol/L)1μl, 10×PCR Buffer 2.5μl, MgCl2(2mmol/L ) 1.5μl, TaqDNA聚合酶0.25μl，总体积

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