ptonin，0.5 mmol/L PMSF，2.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，0.1 mol/L Na3VO4，50 mmol/L NaF，2 mmol/L 焦磷酸钠)，匀浆器抽压35次。匀浆组织液以4℃ 800 g离心10 min，将抽取的上清以4 ℃ 165 000 g离心1 h后所得的第二次上清即为胞浆组分。Bradford法测定蛋白浓度后，将其保存于-20℃冰箱备用。
1.3.4 蛋白印迹分析
SDSPAGE凝胶电泳。0.45 μmPVDF膜湿法电转膜。室温下3%BSA封闭1 h。置于摇床上与抗bcl2多克隆抗体(1∶1 000)及抗bax 多克隆抗体(1∶1 000)4℃下孵育过夜。室温下与二抗(抗兔)孵育1 h。再与ECL一起孵育1 min，然后经过曝光，显影，冲洗，定影等步骤，将冲洗后的胶片扫描到电脑中，用Kodak 1D软件测定每一个条带的灰度值。
1.4 统计学处理
所有数据以x±s表示，用STATA10.0统计软件进行数据处理。
2 结 果
2.1 海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡数量
见图1。在显微镜下，死亡神经元呈现胞核固缩深染，呈现多角形，胞浆粉染。假手术组中，海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层各脑区神经元死亡率为0。缺血组中海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元死亡率分别为(98.2±1.1)%、(95.5±2.2)%、(54.3±11.5)%、(11.7±4.3)%、(23.1±8.6)%;人参皂甙Rb1组各脑区的死亡率分别下降至(55.2±9.7)%、(5.4±2.4)%、(4.3±3.1)%、(2.4±1.2)%、(3.7±1.9)%。与缺血组相比较人参皂甙Rb1组各脑区的死亡率显著下降(均P<0.01)。
2.2 蛋白印迹
见图2。与对照组相比，缺血后bcl2表达在DG区明显减少(P<0.05)，在CA1区及皮层区神经元内显著减少(均P<0.01);而bax表达在CA1区、DG区及皮层区均显著增加(均P<0.01)。与缺血组相比，Rb1组在CA1区、DG及皮层神经元内的bcl2表达均显著增加(均P<0.01)，而bax表达在DG区明显减少(P<0.05)，在CA1区及皮层区均显著减少(均P<0.01)。
3 讨 论
1982年Kirino〔4〕报道了短暂脑缺血后海马CA1区神经元延迟性死亡现象，即当缺血结束时CA1区神经元并不马上死亡，而是在再灌注若干天后才发生死亡。此后，有学者发现，延长缺血时间，海马CA2区、CA3区、DG区及皮层神经元均能发生延迟性死亡。本文发现对照组中海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元表现胞核固缩深染、呈多角形、胞浆粉染，均为神经元死亡的病理特征，但假手术组中各脑区的神经元无死亡;在对照组海马CA1区和CA2区神经元几乎全部死亡;CA3区神经元大约有半数死亡;DG和皮层神经元死亡较少。我们以往研究发现，较短时间缺血后，只有海马CA1区神经元死亡，而其他各脑区则无神经元死亡。因此，认为 各脑区神经元死亡的差异可能与各区神经元对缺血耐受程度不同有关。
有学者〔5，6〕发现人参皂甙Rb1能够延长原代培养的大鼠海马神经细胞存活时间、降低神经细胞的死亡率，并研究了人参皂甙Rb1对局灶性脑缺血的保护作用。但是人参皂甙对短暂脑缺血后大鼠海马及皮层各脑区神经元的影响尚不清楚。我们在缺血前3 d采用腹腔注射的方法给予人参皂甙Rb1，然后进行15 min全脑缺血，结果发现与对照组相比较海马CA1区、CA2区、CA3区、DG区和皮层神经元的死亡率均显著减少。同时采用差速离心分离了CA1区、DG区及皮层神经元的细胞浆，结果发现人参皂甙Rb1对神经元的保护作用是通过上调凋亡抑制基因bcl2及下调凋亡促进基因bax实现的，这与采用外伤模型研究人参皂甙Rb1保护神经元损伤的结果一致。因此，认为人参皂甙保护神经元抵抗缺血性损伤的作用是通过上调bcl2和下调bax基因实现的。人参皂甙保护神经细胞的作用机制：①人参皂甙Rb1调节凋亡调控基因的表达，Bcl2蛋白的表达与人参皂甙Rb1的浓度呈正比，而Bax 蛋白的表达与人参皂甙Rb1的浓度呈反比〔7〕。②人参皂甙Rb1能够增加细胞膜的稳定性，减少神经细胞LDH的释放量〔8〕;③人参皂甙Rb1能够清除自由基，抑制脂质过氧化物形成〔9〕。本研究证实了人参皂甙对全脑缺血后大鼠各脑区的保护作用，但是缺血
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