关于冻化疗对G422胶质瘤细胞凋亡及调控机制的影响

　　1.2实验设计

　　1.2.1实验分组：待肿瘤生长至第9天，直径约2 cm，随机将动物分组：①对照组50只;②实验组150只，其中单纯化疗组、单纯冷冻组和冻化疗组各50只。冷冻、化疗、冻化疗实施后各组于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每时间点各10只。

　　1.2.2冷冻实施：单纯冷冻组用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后切开瘤旁皮肤，暴露肿瘤，用直径约5 mm探头(LCS-3000型冷冻治癌机，美国产)插入肿瘤中心，冻后90 s后自然复温(探头温度为-180 ℃);单纯化疗组：经腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu，18 mg/kg，上海旭东海普药业有限公司产);冻化疗组：冷冻实施与单纯冷冻组同，冻后5 min即经腹腔注射5-Fu(18 mg/kg);对照组未经任何处理。每组于各时间点处死动物切取瘤块按不同检测要求保存标本。

　　1.3细胞凋亡的原位检测4%多聚甲醛灌注固定标本，石蜡包埋，4 μm厚的切片作TUNEL染色，检测细胞凋亡，按原位细胞凋亡检测试剂盒(boehring Mannheim, Germany)说明进行。凋亡细胞核为棕黄颗粒染色，用装有目镜网格测微尺的光镜(400×)计算凋亡细胞数(个/0.0625 mm2)。

　　1.4免疫组化染色4 μm厚的石蜡切片，58 ℃烤片45 min，脱蜡入水，微波抗原修复，滴加一抗浓度为p27kip1多抗(Santa Cruz公司)1∶100， 4 ℃孵育过夜，SP药盒染色(SP-9001，北京中山)。p27kip1阳性表达为胞核呈棕黄色或棕褐色颗粒沉着，400倍光镜下每张切片计数单位视野阳性细胞数占细胞总数百分比，至少计算1 000个细胞，阳性细胞所占比率为p27kip1蛋白表达的百分数。

　　1.5统计学处理实验数据以x±s表示，采用SPSS 10.0数据统计软件进行单因素方差分析。对冷冻后p27kip1蛋白表达及凋亡细胞采用Pearson相关性分析。

　　2结果

　　2.1TUNEL染色结果凋亡细胞出现胞核和胞质结构上具有特征性的改变;冷冻后肿瘤的冻心区以大片非特异性浅黄色坏死为主，冷冻周边区凋亡细胞增多，单纯化疗后凋亡细胞散在或灶状分布;冻化疗联合组除具有单纯冷冻后凋亡细胞分布特点外，远离冻心的周边区凋亡也大为增多，其各时点TUNEL阳性细胞数显著多于其它各组;对照组仅有少量凋亡细胞散在分布。各组不同时间点细胞凋亡的变化见表1。 表1 各组不同时间点细胞凋亡的变化

　　2.2p27kip1蛋白表达p27kip1蛋白表达位于胞核呈棕黄色染色，对照组p27kip1阳性细胞比较均匀分布于肿瘤组织中，单纯化疗组与对照组比有显著性差异;实施局部冷冻后，冷冻中心几乎没有阳性表达，冻周区于冻后24、48、72 h表达明显增多，冻化疗后周边区各时间点p27kip1蛋白表达增加更为明显。冷冻和5-Fu对p27kip1蛋白表达的影响见表2。表2 冷冻和5-FU对p27kip1蛋白表达的影响(

　　2.3 p27kip1蛋白表达与凋亡细胞数相关性分析经Pearson相关性分析表明，冷冻后p27kip1蛋白表达与凋亡细胞数呈正相关(P<0.01)。3讨论研究表明冷冻使胶质瘤细胞产生凝固性坏死的同时，也可诱导其发生凋亡[2]，以往的观点认为，冷冻能够提高肿瘤细胞内5-Fu药物浓度，其原因与冻后血管内皮细胞紧密连接暂时开放、血管通透性增加有关[3]。本试验发现化疗药5-Fu可诱导胶质瘤细胞凋亡，冷冻诱导胶质瘤细胞凋亡的作用比5-Fu更明显，冻化疗的联合应用显著提高了肿瘤细胞的凋亡率。

　　p27kip1是一种细胞周期调节蛋白，于1994年Polyka等[3]在研究细胞抑制的机理时发现，在经转化生长因子-β和接触性抑制处理的细胞中存在一种分子量为27 kD的细胞周期抑制蛋白，它能与cyclin-CDK2和cyclin-CDK4复合物紧密结合，即为p27蛋白。p27kip1蛋白具有限制性调节细胞周期进程的作用，其水平随着细胞周期进程的改变而改变，p27kip1能广泛抑制各种周期素和CDK的活性使细胞周期停滞在G1期。p27kip1除了通过影响细胞周期的进程来干扰细胞的增殖外，其水平的高低还与细胞

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