缺氧复氧性损伤对培养海马细胞ICAM 1表达影响

　　Key words: hypoxia, brain; hippocampal neuron cells; ICAM-1; YinXinDaMo

　　目前认为缺氧复氧性损伤及钙反常性损伤是一个问题不同侧面的反映，虽然已有许多在体实验研究再灌注损伤的发生机制，但其确切的机制仍不清楚，研究还发现缺血再灌注损伤的原因是多因素所致的复合性损伤。但是，致损途径中的几个环节还仍不清楚。近来，细胞间黏附分子1(ICAM-1)的关系及其介导的中性粒细胞与内皮细胞粘附，引起中性粒细胞海马细胞的浸润增加，以及一氧化氮、一氧化氮合酶(NOS)、[Ca2+]i对氧自由基与再灌注损伤的关系引起了人们的关注。为此，我们利用海马细胞缺氧复氧性损伤模型，研究缺氧复氧时ICAM-1、NOS、细胞胞浆游离钙([Ca2+]i)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)等的变化规律以及银信达莫对其表达的影响，探讨银信达莫对海马细胞缺氧复氧性损伤的保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠，体重(250±10)g;24h内SD新生鼠，均由南通大学实验动物中心提供。

　　1.1.2 主要试剂

　　DMEM干粉型培养基，新生牛血清;1∶250胰蛋白酶(Difco产品，美国);银杏内酯B(中国药品生物制品检定所);MDA、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)、[Ca2+]i、NOS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.1.3 主要仪器

　　倒置显微镜(重庆光电公司)，酶标仪(美国BIORAD公司)，二氧化碳孵育箱(法国JOUAN公司)，冷冻高速离心机(Hittech)，超净工作台(上海净化设备厂)等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 海马神经细胞的培养

　　取新生1天的SD大鼠，75%乙醇消毒，无菌条件下取脑，分离双侧海马，剔除血管，用冰浴D-Hanks液洗2次，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶2ml，37℃、5% CO2培养箱中消化30min，每5min振荡1次。用等体积含10%胎牛血清的DMEM终止消化，吹打成细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM吹打成细胞悬液，分别经60目和200目的筛网过滤，并将滤液细胞数调整至5×105/ml，以100μl接种于涂有0.1mg/ml poly-L-lysine 96孔培养板中，使各孔细胞数基本相同，37℃、5% CO2培养箱中培养，24h后全量换液，48h后加入终浓度为10μmol/L阿糖胞苷作用24h更换新培养液，以后每2天半量换液，培养6天的海马神经细胞，用于实验。

　　1.2.2 培养细胞缺氧复氧模型制作、干预方法

　　收集培养至第5天的贴壁海马细胞制作细胞悬液，将细胞悬液浓度调整至105/ml，置于充有95%N2与5%CO2混合气体(37℃)的孵箱中缺氧1h，然后再置入95%O2和5%CO2孵箱中复氧6h;取细胞标本备测。银信达莫干预组于缺氧前1h加入药物EGB(50μg/ml)，其余处理同缺氧复氧组。

　　1.2.3 检测方法

　　培养海马细胞用半定量ELISA法测定其ICAM-1的含量，ICAM-1单克隆抗体浓度为1∶3000(对照管不加抗体)，TMB显色，DG3022型酶联免疫吸附检测仪在449nm处测定光吸收值。海马细胞NOS检测用精氨酸比色法测定。海马细胞GSH含量测定参照二硫代硝基苯甲酸比色法测定。海马细胞游离钙测定用Fura2荧光分光光度法，海马细胞MDA用硫代巴比妥酸比色法测定，海马细胞SOD活性测定用黄嘌呤过氧化物酶法。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据以(±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析，上述统计分析用Stata 7.0统计软件完成。

　　2 结果

　　2.1 培养海马细胞ICAM-1表达变化及干预的影响

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