检测效应细胞体外特异性杀伤活性 将上述4种效应细胞分为4组即MHCCTL组、HSPCTL组、MHCHSPCTL组及WCTL组与靶细胞按比例加于96孔板中，每孔200 μL，不足部分加含10%小牛血清RPMI1640培养液，每个处理孔设3个复孔，其中靶细胞浓度为1×105mL-1效应细胞浓度为1×106 mL-1。培养培养24 h后加入MTT液37 ℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO充分振荡，于96孔酶标仪上490 nm波长测其D值。靶细胞为U251野生型[w(t)]。效靶比率为50∶1。
1.2.3 靶细胞受攻击后超微结构 经效应细胞攻击后的靶细胞离心沉淀，经3%戊二醛1.5%多聚甲醛0.1 mol/L PBS (pH7.2)4 ℃固定数天或数小时;1%锇酸1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h;PBS漂洗;70%酒精饱和醋酸铀染液4 ℃过夜、酒精丙酮脱水，环氧树脂618包埋。超薄切片机切80 nm，经醋酸铀、柠檬酸铅分别染色5 min;在日立Hu12A型透射电镜下观察并摄片。
1.3 统计学处理 测定结果数据以x±s表示，应用SPSS 11.5软件对检测数据进行统计学处理，各实验组杀伤活性的两两之间比较行t检验。P<0.05为差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 MTT比色法检测结果 WCTL、MHCCTL、HSPCTL及MHCHSPCTL组对野生型U251细胞的杀伤率分别为：(13.84±5.70)%，(58.50±5.05)%，(63.28±4.91)%，(78.31±4.56)%;MHCHSPCTL组、HSPCTL组、MHCCTL组和WCTL组两两之间对野生型U251的细胞毒性杀伤率的比较具有统计学意义(P<0.05)，其中以MHCHSPCTL组的杀伤率最高[(78.31±4.56)%];WCTL的杀伤率最低[(13.84±5.70)%]。
2.2 透射电镜观察结果 透射电镜发现未受攻击的肿瘤细胞生长状态良好，胞膜上可见微绒毛(图1)，3种效应细胞攻击后的靶细胞出现不同种程度凋亡和的胀亡样表现。凋亡细胞核染色质凝集成块状边聚集于核膜下或核固缩，但本实验尚未观察到典型的凋亡细胞及凋亡小体形成(图2);胀亡细胞表现为胞体增大，肿胀;胞质空泡化;内质网肿胀;线粒体脊变短甚至消失;胞核内染色质分散，凝集在核膜或核仁周围，细胞核有伪足伸出，最后细胞崩解，核溶解(图3)。有些受攻击的细胞具有凋亡样细胞及胀亡样细胞两种混合形态学表现。坏死细胞表现为胞体变小，胞浆基质密度增加，核固缩，染色质呈片状聚集于核膜下(图4)。 在MHCCTL、HSPCTL攻击组靶细胞可见凋亡样坏死，也可见少量胀亡样坏死;MHCHSP CTL攻击组靶细胞胀亡样坏死较多见，部分为凋亡样细胞及胀亡样细胞两种混合形态学表现。
3 讨 论
本组实验结果显示，MHCHSPCTL组对野生型人脑胶质瘤细胞的细胞毒性明显高于HSPCTL、MHCCTL及WCTL组(P<0.05)，笔者推测HSP70和MHCI类分子双高表达相对于可将低细胞胀亡样坏死：细胞质基质密度下降,内质网扩张,线粒体肿胀, 嵴变短,甚至消失,染色质凝集成块状聚集于核膜下,核膜破裂,不完整. 免疫原性的人脑胶质瘤细胞胞内的免疫原性肽以HSP肽复合物的形式和MHCI肽复合物的双重形式表达于细胞膜上，一方面能够与树突状细胞(dendritic cells, DCs)及单核细胞/巨噬细胞上的CD91(α2巨球蛋白受体)等受体结合，促APCs成熟及活化,进而引发特异性的CD8+T细胞反应[5]，另一方面又可通过肿瘤细胞自身作为抗原递呈细胞的作用以MHCI肽复合物的形式表达于细胞膜上供效应性T细胞识别。其具有双重激活免疫系统机制，且这双重机制所产生叠加/协同作用可产生强大的杀瘤作用，明显优于HSP70或MHCI类分子高表达GBM U251细胞疫苗。
透射电镜发现效应细胞攻击后的靶细胞出现两种不同坏死表现即凋亡样坏死和胀亡样坏死。凋亡和胀亡代表了两种不同的细胞死亡方式。细胞凋亡是细胞的主动死亡过程，其从启动到结束都是在基因的严密调控下进行的，基本形态特征表现为细胞萎缩。而细胞胀亡是一种无规律的细胞死亡，是细胞缺乏ATP的被动死亡过程，其发生与基因调控关系尚不明确。基本形态态特征表现为细胞的肿胀。坏死是指细胞死亡后发生的形成学改变，包括核浓缩、核碎裂、核溶解及胞质浓缩、强嗜酸性、结构崩解等一系列变化，至少可由细胞凋亡和细胞胀亡2种不同途径引发。坏死前细胞表现凋亡特征称为凋亡样坏死，若表现
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