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大鼠肢体缺血再灌注早期血栓前状态的研究 |
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股沟处沿血管走行纵行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉、股静脉和股神经。在股动、静脉近端分别用动、静脉夹夹闭，并用张力带于股鞘下绑扎肢体阻断侧支循环。右颈部开口分离颈内静脉，置管建立静脉输液系统，接微电脑静脉微量输液泵。2 h后撤除血管夹，恢复动、静脉血流，3 h后进行标本采集。
1.2.3 实验动物的处理 假手术组与缺血再灌组相同的麻醉与手术操作，但未行血管夹闭及张力带绑扎；缺血再灌注组缺血2 h，再灌注3 h。
1.2.4 标本制备和检测方法 检测GPⅡb/Ⅲa需取血，从心脏采血0.5 mL(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)，1 000 r/min离心5 min，取上清5 uL加入试管中；加入一抗5 uL，避光孵育20 min；加入荧光标记二抗5 uL，避光孵育20 min；加1％多聚甲醛200 uL固定30 min；PBS洗涤4 min，用流式细胞仪检测，每管收集GPⅡb/Ⅲa阳性细胞20 000个，记录GPⅡb/Ⅲa的阳性率。
检测TM需取血管，取股动脉、股静脉，脱水、石蜡包埋，用免疫组化方法定性检测血管内皮细胞上TM的表达。步骤如下：a)切片常规脱蜡至水，二甲苯(20 min)→二甲苯(20 min)→100％酒精(10 min)→100％酒精(10 min)→95％酒精(10 min)→85％酒精(10 min)→70％酒精(10 min)。b)3％H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的作用。蒸馏水冲洗2 min，冲洗3次。c)热修复抗原：将切片浸入0.001M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔8 min后，重复1次，冷却2 h，冷却后PBS液(pH 7.4)洗涤2 min，冲洗2次。d)滴加5％BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。e)滴加稀释1∶50的一抗(抗大鼠IgG)，4℃过夜。PBS液冲洗2 min，冲洗3次。f)滴加生物素标记的羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS液冲洗2 min，冲洗3次。g)滴加试剂SABC室温20 min。PBS液冲洗5 min，冲洗4次。h)DAB显色，自来水冲洗。i)苏木素轻度复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。再用BX51型Olympus显微镜及IDA2000数码显微图像分析系统进行图像分析，每组观察30个高倍视野(×400)，随机取8个视野，以平均光度为指标进行半定量分析。
1.3 统计学分析 用SPSS 11.5统计软件，实验数据以(±s)表示，组间均数比较采用t检验。检验水准取α＝0.05，P＜0.05差异有显著性。
2 结 果
2.1 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa表达为(53.84±3.05)，高于假手术组(42.31±6.29)，二者比较具有统计学意义。
2.2 缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P＜0.05)(见表1)表1 急性肢体缺血再灌注大鼠血管内皮细胞TM的表达注：假手术组与缺血再灌组比较P＜0.05
3 讨 论
早在1944年，Jesse等［5］对止血带引发休克研究发现，止血带使用时间不超过3 h，引发止血带休克可能性极小，相反止血带使用时间超过3&n上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页
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