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不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究 |
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软骨细胞分组情况 将生长于对数增长期的兔膝关节软骨细胞分为5组，并按照以下方法进行转染，a)第1组：先加病毒上清，6 h后补充培养液；b)第2组：先加病毒上清，隔夜补充培养液；c)第3组：先加病毒上清，6 h后更换成培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后更换成培养液；d)第4组：先加病毒上清，6 h后补充培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6 h后补充培养液；e)第5组：经典转染法，同时加病毒上清液和培养液。分别收集转染后72 h的细胞上清液，并冻存待检。
1.2.5 免疫荧光倒置显微镜观察转染情况 转染后48 h，在无菌条件下将细胞培养板放置在免疫荧光倒置显微镜下观察荧光情况。
1.2.6 NO含量检测(硝酸还原法) 将收集好的各组细胞培养上清液，按照一氧化氮检测试剂盒说明书进行操作。
1.2.7 酶联免疫吸附(ELISA) 分别检测各组细胞培养上清液中IL1Ra的表达情况，具体操作参照ELISA检测试剂盒说明书。
1.2.8 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差表示，两组间均数比较采用单因素方
差分析，计算总体差异并进行两两比较，P＜0.05为差异有显著性意义。
2 结 果
2.1 逆转录病毒载体PLNCX2IL1RaGFP的构建、包装和滴度测定 重组基因PLNCX2IL1RaGFP经酶切鉴定测序，Il1Ra、GFP序列均正确，基因可以通读。转染到包装细胞并筛选培养后，转染NIH3T3细胞并计算病毒滴度为1×106 C.F.U。
2.2 分组转染后倒置荧光显微镜下观察 倒置荧光显微镜下观察细胞，可见明显的绿色荧光反应，证明转染成功，见图1～2。
2.3 转染后细胞培养液中NO的含量测定 采用NO检测试剂盒检测1～5组的NO含量：a)第1组为(95.92±6.23) μmol/L；b)第2组为(111.48±6.12) μmol/L；c)第3组为(132.59±5.49) μmol/L；d)第4组为(155.47±7.77) μmol/L；e)第5组为(89.77±4.73) μmol/L。其中以第4组为最高，第5组为最低，两两比较均有统计学意义(P＜0.05)。
2.4 ELISA检测目的基因的表达及其转染效率的鉴定 ELISA检测各组上清液中IL1Ra的表达情况，1～5组培养液中hIL1Ra的含量：a)第1组为(48.97±3.74) ng/L；b)第2组为(55.43±3.94) ng/L；c)第3组为(59.73±3.64) ng/L；d)第4组为(65.47±4.60) ng/L；e)第5组为(42.13±3.38) ng/L。其中以第4组为最高，第5组为最低，两两比较均有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨 论
病毒类载体在基因转染中是最常见的载体之一，特别是逆转录病毒载体。鉴于其能稳定地整合入宿主细胞染色体内，尤其包装后的载体转染效率大大提高，具有宿主范围广等优点，因此，世界各地的学者们都在积极的研究这一具有潜力的载体，上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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