压力对体外培养的牛角膜内皮细胞的影响

【摘要】  目的 观察压力对体外培养的牛角膜内皮细胞形态结构及细胞活力的影响。方法 对体外培养的牛眼角膜内皮细胞施以2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa的压力各6、12、24、36、48 h，以不加压组作为对照组。用倒置相差显微镜及电镜观察细胞形态结构，以台盼蓝染色观察比较48 h时各组细胞活力的差别，用单因素方差分析比较不同压力下阳性细胞率。结果 当作用于细胞的压力为2.67 kPa (1 kPa=7.5 mmHg)，作用时间为6、12、24、36、48 h时，与对照组比较，细胞形态结构均无明显变化；48 h时台盼蓝计数与对照组比较差异无统计学意义(P＝0.776)。当压力为5.33 kPa，作用时间为24 h时，细胞形态结构出现轻度的损伤，在36、48 h时加重；48 h时台盼蓝计数与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.00）。当压力为8.00 kPa时，6 h时即出现明显细胞形态结构损害，随着压力和作用时间的进一步增加，细胞的损伤程度也进一步加重；48 h时台盼蓝计数与对照组比较差异有统计学意义(P＝0.000)。结论 牛角膜内皮细胞在加压48 h时只能承受2.67 kPa的压力，当压力为5.33 kPa及8.00 kPa，施压48 h时，将造成细胞损伤及细胞活力下降。

【关键词】  压力；角膜内皮细胞；角膜水肿

角膜内皮细胞是位于角膜最内层的单层细胞，其完整性以及一定的细胞密度对于保持角膜脱水状态，并维持正常角膜厚度与透明性至关重要。当急性闭角型青光眼急性大发作,或其他原因导致眼压骤然升高时，角膜常失去脱水状态，从而导致角膜水肿、混浊。目前虽已证实高眼压所导致的角膜水肿是角膜内皮细胞受损引起，但压力对角膜内皮细胞本身的影响尚未完全明了。本研究通过构建压力模型，研究不同程度压力对牛角膜内皮细胞（bovine corneal endothelial cells，bCEC）的影响。

    1  材料和方法

    1.1  材料及试剂  胰蛋白酶（美国，Sigma公司），EDTA（武汉，凌飞科技有限公司），胎牛血清、DMEM （美国，Gibco公司），青霉素、链霉素、台盼蓝（上海，碧云天生物技术有限公司）。

    1.2  牛角膜内皮细胞培养  新生小牛来自武汉市吴家山奶牛场，于宰杀后立即将牛眼取出，用无菌的1：5000 HgOH溶液及生理盐水冲洗后，于2 h内用冰瓶运回进行组织培养。角膜内皮细胞的培养采用Li等[1]的方法。无菌状态下将角膜内皮向上放在一个浅的半球状固定容器内，用无钙的PBS液清洗。在角膜内皮上加入1 ml含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液，在培养箱内放置5～10 min。然后用塑料小杆轻轻刮擦角膜内皮，将分散的细胞用吸管转入含有10%胎牛血清和100 U/ml的青霉素和100 ng/ml链霉素的DMEM的25 cm2的培养瓶中，在5% CO2、37℃、95％湿度的培养箱中培养，每隔2～3 d 换培养基。在5～7 d细胞融合后进行传代，将传至第3代的细胞用于实验研究。

    1.3  细胞加压模型的建立及分组　　第3代牛眼角膜内皮细胞铺满瓶底及瓶内预置的盖玻片后，按张文强等[2]的细胞加压方法建立细胞加压模型，设加压压力分别为2.67 kPa、5.33 kPa及8.00 kPa (1 kPa=7.5 mmHg)各组为实验组， 未加压组为对照组，于37℃恒温培养箱中培养，每组细胞重复6瓶。分别于细胞加压6、12、24、36、48 h时取出部分盖玻片并收集细胞，做光镜和透射电镜观察。

    1.4  细胞形态和结构观察  取出各组瓶内预置的盖玻片，切片予常规脱蜡，水化，封闭，用PBS冲洗3次，瑞氏-吉姆萨染液染色30～60 s，PBS冲洗2～3次，苏木素复染，干燥后用中性树胶封片，用倒置相差显微镜观察细胞形态。另一部分行电镜切片，用PBS液冲洗2遍，在2.5%戊二醛液中固定30 min，以1%四氧化锇固定30 min，梯度酒精脱水，以Epon812环氧树脂做单层细胞包埋，用钻石刀做超薄切片，染色后经Hi-tachi Hu-11A透射电镜观察。

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